本發明涉及玉米粗縮病病原的快速檢測技術及其在病害診斷和測報上的應用，屬于農業科學技術領域。

背景技術：
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玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease，MRDD)在我國病原物為水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，屬于呼腸孤病毒科斐濟病毒屬第二組成員，以灰飛虱為主要傳毒介體進行持久性傳播，灰飛虱一旦染毒，終身帶毒，并能連續傳毒，但不經卵傳毒。自然條件下，主要寄主有水稻、玉米、大麥、小麥、高粱、粟、看麥娘、稗草及狗尾巴草等禾本科植物。感染玉米粗縮病玉米植株的典型癥狀為植株矮縮，葉色濃綠，葉片僵直、寬短而厚，葉背面出現蠟白色短條狀突起，后期變褐色，籽粒較少或不結籽粒。自1954年在新疆和甘肅省發現該病害以來，玉米粗縮病在我國各玉米產區均有不同程度發生，特別是近年來由于氣候環境變化和種植結構的調整，玉米粗縮病的發生呈現明顯的上升趨勢，給玉米產量帶來嚴重損失。

目前植物病毒鑒定常用的方法有：生物學接種實驗、血清學檢測、電鏡觀察及分子生物學方法。這些方法大都需要特定儀器且耗時久，不適用于田間快速檢測。環介導恒溫核酸擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年發明的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，是一種高靈敏鏈置換技術，一種新型PCR替代技術。LAMP特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶-Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA polymerase在恒溫(60-65℃)的條件下反應1小時左右即可完成核酸擴增反應。鈣黃綠素是一種熒光染料，在LAMP反應之前加入到反應體系中，避免了開蓋造成的反應產物污染，這與SYBR Green I染料不同。通過熒光染色直接目測比色就可以得到清晰的反應結果。不需要長時間的溫度循環，不需要PCR儀等昂貴的儀器，不需要繁瑣的電泳紫外觀察等過程。目前已廣泛應用于人類和動植物各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測和快速診斷中。

技術實現要素：
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本發明提供了一種快速檢測玉米粗縮病病原的方法，通過該方法可以快速診斷出玉米是否攜帶該病毒。

本發明所提供的一種快速檢測玉米粗縮病病原的方法，是通過以下方法獲得的：

1)根據NCBI已報道水稻黑條矮縮病毒S10核苷酸序列，通過軟件DNAstar分析后選擇相對保守區域700-1700bp，利用AJ297433.1上對應區域通過在線引物設計軟件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計4條引物，其中包括2條外引物F3/B3和2條內引物FIP/BIP；

2)Trizol reagent提取植株總RNA；

3)設置不同內外引物濃度比例、Mg²⁺濃度、Mn²⁺濃度、鈣黃綠素濃度，確定最佳反應體系；分別改變反應時間和溫度進行RT-LAMP擴增反應，確定最佳反應條件；

4)與RT-PCR方法進行比較，驗證RT-LAMP方法的可靠性；

本發明提供的引物序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

RIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

RT-LAMP的反應溫度為60-65℃，反應時間為90-150min。

一種檢測玉米上玉米粗縮病病原方法的應用包括：玉米疑似病株的快速診斷與鑒別。

利用這一方法可以快速鑒定出玉米植株是否感染玉米粗縮病，進而采取針對性的防治策略，減少病害帶來的損失。

附圖說明：

圖1：不同反應溫度條件下RT-LAMP結果的電泳圖(A，RT-LAMP反應電泳圖；B，鈣黃綠素顏色變化圖；M，標準分子量；1，60℃；2，61℃；3，62℃；4，63℃；5，64℃；6，65℃；7，陰性對照)。

圖2：不同反應時間條件下RT-LAMP結果的電泳圖(A，RT-LAMP反應電泳圖；B，鈣黃綠素顏色變化圖；M，為標準分子量；1，30min；2，60min；3，90min；4，120min；5，150min；6，陰性對照)。

圖3：RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較圖(A，RT-LAMP反應電泳圖；B，RT-PCR反應電泳圖；C，鈣黃綠素顏色變化圖；1-9，1.0578μg/μL-1.0578×10^-8μg/μL；10為陰性對照)。

具體實施方式：

下面實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。

實施例1，玉米粗縮病毒RT-LAMP反應條件的優化

(1)引物設計。

根據NCBI上已報道的水稻黑條矮縮病毒S10核苷酸序列設計引物。選取相對保守的一段序列699-1699bp作為模板，使用在線LAMP引物設計軟件primerExplorer V4(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設計引物。將模板序列上傳后，由系統軟件計算獲得初步的LAMP引物組合(F3，B3，FIP，BIP)，再通過軟件提供的引物相應的3’端或5’端穩定性及引物二聚體等參數對設計出的多對引物進行比較選擇，選取5組合適的引物，再用外引物F3/B3PCR驗證，最終確定序列如下：

F3 TTTCGGCTTTGAAAACAGT

B3 TGCCATCGTAATTAGTGCG

FIP TGCGCTCCAAGTTTGTTCGATGAAAAAGAACTAAGTGTTTTGG

BIP ATTTGTTGAAACATGGCAGGTTAAACGTGGACAAACTGGTCAAT。

(2)溫度梯度實驗

從南京江蘇省農業科學院采集玉米病株，參照季英華等RT-PCR方法篩選出玉米粗縮病樣品用于RT-LAMP檢測試驗(季英華等，《中國水稻科學》，2011)。參照Reagents(康為世紀)使用說明，提取樣品總RNA。雖然Bst DNA polymerase的最適反應溫度為65.8℃，但許多報道已經證實RT-LAMP適宜反應溫度在60℃-65℃之間，同時由于不同引物的Tm值不可能完全一致，而且RT-LAMP還要考慮到反轉錄酶的適宜反應溫度，因此，本發明對RT-LAMP反應溫度進行優化試驗。RT-LAMP體系為：外引物F3和B3各0.2μM，內引物FIP和BIP各1.2μM，1.4mM dNTP混合物，8mM MgSO₄，0.5mM MnCl₂，50μM鈣黃綠素，20mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％TritonX-100，Bst DNA聚合酶，大片段8U，M-MuLV反轉錄酶100U，RNase Inhibitor 20U，0.8M甜菜堿，2μL總RNA模板，補充DEPC水至25μL。混勻反應物在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃六種條件下恒溫反應90min，80℃反應5min終止RT-LAMP反應，直接目測比色或取2μL擴增產物上樣，在1％瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳結果EB染色。結果顯示在同樣反應體系條件下，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃恒溫反應90min后均有階梯狀擴增條帶，61℃，62℃，63℃恒溫反應90min后的擴增產物的電泳條帶亮度幾乎相同，64℃，65℃恒溫反應90min后擴增產物的條帶亮度略微有些減弱，陰性對照無階梯狀擴增帶(圖1)。因此本發明RT-LAMP的反應溫度應為61-63℃。

(3)反應時間梯度實驗

許多報道已經證實RT-LAMP反應時間少于90min也能檢測到擴增產物。按照(2)中已經優化好的RT-LAMP體系加樣后置于61℃恒溫條件下反應，分別設置恒溫反應30min，60min，90min，120min，150min五種處理，按(2)中完成反應后電泳檢測。結果顯示當反應時間為90min時才有擴增產物，但是當反應時間小于90min時，沒有RT-LAMP擴增產物。此后當繼續增加反應時間時，擴增產物的量幾乎不發生改變(圖2)。因此本發明確定的RT-LAMP的反應時間為90-150min。

(4)RT-LAMP與RT-PCR靈敏性比較

為了確定RT-LAMP和RT-PCR兩種檢測方法的靈敏度，將提取的總RNA用紫外分光光度計(Thermo NanoDrop 2000C)測定濃度(1.0578μg/μL)后用DEPC水進行10倍比稀釋，-70℃保存作為模板。分別取總RNA倍比稀釋液2μL作為模板，采用所設引物用(2)中RT-LAMP反應體系進行反應(反應時間為90min)。直接目測比色或取2μL擴增產物上樣，在1％瓊脂糖凝膠上電泳。同時，以RT-LAMP相同的2μL總RNA倍比稀釋液為模板，參照反轉錄試劑盒(大連寶生物)說明進行反轉錄合成cDNA第一鏈。以RT合成的cDNA為模板，以F3和B3為引物進行PCR擴增，使用常規PCR反應體系。取2μL擴增產物上樣，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果EB染色。結果顯示用RT-LAMP方法可以檢測到濃度是1.0578×10^-6μg/μL的玉米粗縮病毒的總RNA，而RT-PCR只能檢測到濃度是1.0578×10^-4μg/μL的玉米粗縮病毒的總RNA，即RT-LAMP比RT-PCR靈敏性高出100倍(圖3)。

一種檢測玉米植株上玉米粗縮病病原的方法應用包括：在玉米疑似病株的快速診斷與鑒別。

上述實施不以任何形式限定本發明。