專利名稱：利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法及其專用雙鏈RNA的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種培育抗粗縮病玉米的方法及其專用雙鏈RNA，尤其涉及利用人工microRNA技術及其雙鏈專用RNA,屬于生物技術領域。
背景技術：
玉米是我國最重要的糧食作物之一，2008年以來，我國玉米種植面積穩定在4. 5億萬畝上下，總產在I. 6億噸左右。然而，隨著我國經濟發展和人民生活水平的提高，特別是畜牧業和玉米精深加工產業鏈的延伸和擴漲，我國對玉米的需求將不斷増加，目前，我國玉米生產面臨巨大的壓力，已經出現嚴重供不應求的局面。另外，玉米病蟲害危害日益嚴重，每年病蟲害造成約1000萬噸的產量損失，約占玉米總產的7%-10%。其中發生較廣、危害較重的是玉米粗縮病。1949年玉米粗縮病(maize rough dwarf virus, MRDV)首次在意大利被發現,此后在阿根廷、法國、西班牙、前南斯拉夫、伊朗等國家都有不同程度的發生。1954年，首次在我國新疆南部、甘肅西部發現MRDV。自20世紀70年代以來，玉米粗縮病在華北、西北和東北的部分地區引發大面積毀種或絕產，成為玉米生產的重要病害。進入90年代，MRDV在我國黃淮海和東北的部分地區危害逐年加重，局部病田病株率達到40%，平均減產10-30% (李懷方等，1996)。1999年在全國玉米種植區造成的危害面積進ー步擴大，其中華北地區、江蘇沿海地區危害最重。最近幾年玉米粗縮病在北方冀、魯、陜、晉、遼、津等省市暴發成災，其中山東省自2005年以來已連續4年嚴重發生，主要發生在臨沂、泰安、濟寧等魯南地區，發病率在10%-70%，其中，2007年曲阜市玉米粗縮病發生面積達12萬畝，造成2萬多畝絕產。2008年山東省因粗縮病造成玉米絕產面積25萬畝，病株率在2%-10%之間。2008年安徽宿州、河南東部、河北鹿泉市粗縮病也比較嚴重。發病較重的品種主要有雅玉12、皖玉7號和鄭單958、登海9號。在我國大部分地區分離到的玉米粗縮病的病原是水稻黑條矮縮病毒(RiceBlack-streaked Dwarf Virus, RBSDV)，該病毒是ー種具有雙層衣殼的球形病毒，存在于感病植株葉片凸起部分的細胞中，病毒粒子呈正二十四面體，具有雙層外売。該病毒基因組包含10條線狀的雙鏈RNA片段，屬于植物呼腸弧病毒組斐濟病毒屬(王朝輝等2004，方守國等2000，張恒木等2001)，玉米粗縮病感病植株扭曲，節間縮短呈叢生狀，植株嚴重矮化，病株株高僅為健康植株株高的1/2。葉片寬短脆硬，葉色濃綠，節間粗短，頂葉密集簇生；葉背、葉鞘及苞葉的葉脈上產生粗細不一的蠟白色條紋狀突起，手觸時有明顯粗糙感。4-5葉前感病植株少有抽穗，7葉后感病植株能抽穗結實，但雄穗發育不良或退化，花粉少；雌穗短小畸形或無雌穗，結實少，果穗小而畸形，嚴重時不能結實。玉米粗縮病主要通過灰飛虱傳播，病毒主要在冬小麥和灰飛虱體內越冬，目前生產上推廣品種的抗性大部分處在高感或感病水平，未見抗性較好的品種。目前該病的防治主要靠調整玉米播種期以避開灰飛虱的遷飛高峰期、清除田間雜草切斷其侵染循環中的鏈條等農業措施，結合捕虱靈，植病靈等藥化學殺蟲防病為主。但是農業措施和藥劑處理只能停留在治的水平上，不能從根本上解決玉米粗縮病的危害。近年來，玉米粗縮病毒病原基因組的研究已經取得了豐碩的成果。RBSDV和MRDV的基因組均由10條雙鏈RNA組成，按其在聚丙烯酰胺上遷移距離由小到大計的順序依次命名為S1-S10。RBSDV和MRDV基因組片段無論在氨基酸水平還是在核苷酸水平都具有相當高的一致性(秦國正等，2006)。RBSDV的基因組大小為29141nt，是目前斐濟病毒屬中基因組最大的ー個。RBSDV的S1-S6均編碼病毒的ー個主要蛋白，其中SI可能編碼RNA依賴的RNA聚合酶；S2長約3813nt，編碼ー個有1226個氨基酸組成的蛋白，猜測很可能是核心結構蛋白；S3長3752nt，編碼ー個有1146個氨基酸組成的蛋白，其編碼蛋白可能是病毒粒子的結構蛋白；S4、S5長3617nt、3163nt，功能未知；S6長2645nt，雖然功能未知但利用計算機軟件對其ニ級結構的預測和數據庫比較分析表明，其編碼蛋白存在高度保守的親水性結構域及多個跨膜區域，可能具有結合RNA及ATPase活性，這些結果表明，RBSDV的S6基因可能具有編碼植物基因沉默抑制子的功能；S7全長大約為2193nt，含有兩個開發閱讀框(0RF)，分別編碼約為41Ku和36Ku的蛋白質ORFl和0RF2，目前已經正式ORFl和0RF2均為 病毒的非結構蛋白；S8全序列約為1936bp，只含有I個0RF，編碼蛋白的分子量約為68Ku，可能是病毒的核心衣殼蛋白；S9全長1900bp，含有2個0RF，其中0RF2保守性極高，編碼ー種24. 2Ku的非結構蛋白。SlO全長1819nt，編碼病毒63ku的外殼蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注冊的RBSDV序列總計有60條，其中20條是從中國玉米、水稻產區分類得到的。RBSDV基因組序列測序及其功能研究的深入，為利用植物基因工程改造玉米優良自交系，培養抗粗縮病玉米新種質奠定了基礎。相比傳統雜交育種，利用基因工程技術手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用増加生產投資，也沒有農藥殘留污染環境，對防治發生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。MicroRNA (或稱miRNA)是生物體內源的非編碼小分子RNA。人工microRNA(Artifical miRNA, amiRNA)技術是利用內源miRNA前體骨架，通過替換miRNA序列產生具有新功能的miRNA。最近人工microRNA在抗病育種的潛力逐漸被人們認識，Schwab等利用擬南芥pre-miRNA172和pre_miRNA319做骨架，將miRNA/miRNA*區替換成與目標mRNA互補的片段，形成了 artifical miRNA，在擬南芥中超表達后引起表型的明顯改變(Schwab 2006)，證明amiRNA可以有效沉默單個和多個靶基因，并且在誘導性啟動子或組織特異性啟動子驅動下均可以特異性地發揮作用；Warthmann等利用水稻osa_MIR528作骨架構建了人工miRNA,成功對水稻祀基因高效干涉(Warthmann)。2006年Niu等通過修飾擬南芥miR159的前體獲得了能夠分別鏢靶P69和HC-Pro的人造miRNAs amiR-P69159和amiR-HC-Pro159，發現表達amiR_P69159和amiR-HC-Pro159的轉基因擬南芥能夠分別特異抵抗TYMV和TuMV病毒感染(Niu，2006)。2007年Qu等設計了鏢靶黃瓜花葉病毒(CMV)的沉默抑制子2b的miRNA并在煙草中表達，獲得抗病毒的煙草植株，并且發現煙草的抗性水平和miRNA的表達水平成正相關(Qu，2007)。相比PTGS (RNAi)介導的基因沉默，人工miRNA在培養抗病毒植物上具有其獨特的應用優勢(I)RNAi介導的基因沉默依賴DCL4途徑，而病毒編碼的抑制蛋白(基因沉默抑制子)可以抑制這種沉默，能夠抑制RNAi機制的發生。AmiRNA通過DCLl途徑，可以避開ー些病毒抑制蛋白的拮抗作用；(2) RNAi介導的基因沉默在植物中轉錄長片段病毒基因組，這些病毒基因組序列可能與植物基因組重組，存在ー些生物安全方面的隱患，而amiRNA只引入21個堿基的外源序列，降低了此類風險的發生；(3)田間病毒多是混合侵染，并不是ー個純的株系，而且病毒株系多、變異快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，無法培育ー種持久廣譜的抗病毒品種，amiRNA可以允許錯配的存在，因而科研針對病毒保守區設計amiRNA，使之有效抑制大多數病毒株系，并且當病毒發生突變后仍然能夠保持抗病毒能力，從而延長品種的壽命；(4) RNAi介導的基因沉默會產生一系列序列信息不明確的siRNAs,往往造成意外“脫靶”現象和非目標基因的沉默等現象，amiRNA只產生I條miRNA成熟體(mature miRNA)，和靶基因的結合更加精確、高效、可控；(5)低溫能夠抑制RNAi介導基因沉默的機制，在低溫(<15°C)條件下，RNAi轉基因種質抗病毒能力明顯下降，容易受到病毒的侵染。而研究表明人工miRNA介導的基因沉默在15°C和24°C下沒有區別，在低溫環境下人工miRNA將更加穩定、高效。 然而在可檢索的現有技術中，利用人工microRNA技術提高玉米抗粗縮病的方法還未見報道。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明提供了ー種利用人工microRNA提高玉米抗粗縮病的方法，并且提供改造microRNA的專用雙鏈RNA序列，實現利用人工miRNA培育抗粗縮病玉米新種質。本發明的技術方案是ー種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的專用雙鏈RNA,其特征是，它是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA ;所述sequenceA如SEQNO. 1-34所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補，或者與sequenceA小于4個堿基錯配的反向互補序列。本發明還提供了ー種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米內源的microRNA,然后以玉米內源的microRNA為模板，以分別含有上述sequenceA和sequenceB的ー對引物進行PCR擴增,將擴增后的序列通過酶切,連接轉化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動子的植物表達載體中；或者或者通過人工合成的方式，直接合成帶有sequenceA和sequenceB的人工microRNA前體序列，然后連接轉化到帶有ubiqutin或者CaMV35S啟動子的植物表達載體中；然后將該植物表達載體通過農桿菌侵染或者基因槍的方法導入玉米中，得到抗玉米粗縮病的轉基因玉米。本發明進ー步的技術方案是所述玉米內源的microRNA為zma_MIR159a,所述擴增用的引物為 primer 7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-seguenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG,和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-seguenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG ；PCR 反應程序為 94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環；72°C 7min。所述的克隆內源高水平表達的microRNA (zma_MIR159a)的方法是，以玉米總RNA為模板，反轉錄成 cDNA。以 primerl :5’ -AGITCCCTCACTCCCCAG-3’ (SEQ NO. 38),primer2 5’ -GGACGCAACAAGCAAAAA-3’ (SEQ NO. 39)進行 PCR 反應，PCR 反應程序為 94 °C 5min ；再94°C 50s, 54°C 45s, 72°C lmin，30循環；72°C 7min ;以擴增后的稀釋產物為模板，以primer3 :5-’TCGATGCTTTGGGTTTGA_3’ (SEQ NO. 40),primer4 :5’-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’(SEQ NO. 41)，以同樣的程序進行第二輪擴增，或者不進行第一輪擴增，直接用primer3和primer4進行第二輪擴增。轉基因玉米苗的分子檢測方法是提取轉基因苗的總RNA，以反轉錄后的cDNA為模板，分別以引物(sequence B, sequenceA), (primer 3, sequenceA)和(sequence B,primer 4)進行PCR檢測。玉米粗縮病毒是造成我國玉米大面積減產甚至絕產的主要病害，由于玉米粗縮病的病原菌主要靠灰飛虱傳播，從苗期到成株期均可發病，且感病期越早，發病越重，所以通過噴施農藥或者栽培措施優化等方法很難防止玉米粗縮病的發生和危害，所以說提高玉米自身的抗病能力是解決玉米粗縮病危害的根本途徑。由于目前缺少對粗縮病高抗的優良自交系，所以通過基因工程手段培養抗病品系將是徹底解決玉米粗縮病的有效途徑。本發明以玉米優良自交系為受體植物，設計了能夠干擾玉米粗縮病毒病原菌的人エmicroRNA載體,通過導入玉米種,成功實現了利用人工miRNA提高玉米對粗縮病的抗性， 具有廣闊的應用前景。本發明的優點(I)相比傳統雜交育種，利用人工microRNA技術手段培育抗病品種是徹底解決玉米粗縮病的根本途徑，而且與藥劑防治相比，它既不用増加生產投資，也沒有農藥殘留污染環境，對防治發生范圍廣、流行速度快的病害更為有效。(2)相比PTGS (RNAi)介導的基因沉默，人工microRNA技術只引入21個堿基的外源序列，不容易造成“脫靶”現象和非目標基因的沉默等現象，生物安全性更高。(3)本發明中人工microRNA載體的構建，采用玉米自身高水平表達的microRNA的前體作為骨架，和傳統的通過引入外源基因改良作物品質有很大不同，一定程度上可以減 少引入外源基因造成的不確定表型，另外也可以減少轉基因引起的爭議。(4)本發明可以用(sequence B, sequenceA), (primer 3, sequenceA)和(sequenceB, primer 4)引物組合對轉基因苗進行快速檢測。


圖I玉米粗縮病毒病原菌S6基因組片段的PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖譜；其中S6為玉米粗縮病毒病原菌S6基因組片段，Marker為分子量標準DL2000。圖2植物表達載體構建圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明做進ー步說明，但不限于此。實施例I克隆玉米內源的microRNA (zma-MIR159a)根據microRNA 數據庫(http://www. mirbase. org/)中玉米 zma_MIR159a (檢索號MI0001809)提供的序列信息提交到NCBI中進行blastN，結果表明zma_MIR159a包含在EST (EE295085)內。根據EST的序列及zma_MIR159a在EST中所在的位置，設計引物primerl :5’-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3’ (SEQ NO. 38),primer2 :5’-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’(SEQ NO.39)， primer3 :5’ -TCGATGCTTTGGGTTTGA-3’ (SEQ NO.40), primer4 5，-GGAGGGGTGGATCAGGAT-3，(SEQ NO. 41)。
提取玉米優良自交系齊319的總RNA后進行純化，方法如下I.稱取0.2g新鮮組織，在液氮中充分研磨至粉末狀，研磨中不斷緩慢加入液氮，防止材料解凍。2.將研好的組織迅速轉移至預熱(65°C )的裝有600微升CTAB提取液(2% CTAB,2% PVP, 0. IM Tris-Cl, 2. OM NaCl, 25mM EDTA)的 EP 管中，立即劇烈渦旋振蕩 30s，使其混勻。3. 65°C水浴2-5min，期間劇烈渦旋振蕩3_5次。4.稍微冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇(氯仿異戊醇=24:1 (V/V)，下同)渦旋振蕩 lmin,混勻，4°C, 12，OOOrpm 離心 15min。5.將上清轉移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。
6.再加入等體積的氯仿/異戊醇渦旋振蕩Imin，混勻，4 °C，12，OOOrpm離心15min。7.將上清轉移到另一新的EP管中，加入1/3體積的8M LiCl，使其終濃度為2M，4 °C過夜沉淀。8. 40C，12，OOOrpm離心20min，棄上清，分別用70%こ醇，無水こ醇洗沉淀，晾干，カロ30-50微升DEPC-H2O,溶解沉淀。9.在微量離心管中加入全部 RNA, DNaseI Buffer 5ul, DnaseIC5U/ul )5ul, RnaseInhibitor (40u/ul)0. 5ul，最后加入DEPC H2O使總體積達到50ul，37°C反應I個小時。10.加入 50ul DEPC H2O,混勻。11.加入等量(IOOul)的苯酚/氯仿/已戊醇(25:24:1),充分混勻。12.離心，取上層水相到新離心管中。13.加入等量(IOOul)的氯仿/已戊醇(24:1)，充分混勻。14.心取上清(水相)到新的離心管。15.加入 1/10 體積(IOul)的 3M NaOAC (pH 5. 2) 。16.加入2. 5倍(250ul)的冷無水こ醇，_20°C過夜(或者一個小時以上)。17.離心回收沉淀，用70%的こ醇清洗，干燥。20.加入20ul DEPC H2O溶解后，電泳檢測。玉米cDNA的獲得參照Takara公司的反轉錄試劑盒說明的方法，在500ul離心管中加入 oligo dT primer lul, dNTP lul，總 RNA 2ul, DEPC H2O 6ul，混勻后，在 PCR 儀上65°C溫育5min后迅速在冰上冷卻，然后再加入5XPrimeScript II Buffer 4. Oul, RnaseInhibitor 0. 5ul,PrimeScript II Rtase I. Oul,最后加入 DEPC H2O,補足 20ul,混勻后在PCR儀上進行，42°C，60min ；70°C , 15min后，冰上冷卻。用稀釋5倍的cDNA做模板，以primerl, primer2進行PCR反應，PCR反應程序為94°C 5min ;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環；72°C 7min ;以擴增后的稀釋 5 倍的產物為模板，以 primer3 :5’ TCGATGCTTTGGGTTTGA 3’，primer4 :5’ GGAGGGGTGGATCAGGAT3’，以同樣的程序進行第二輪擴増。或者不進行第一輪擴增，直接用primer3和primer4進行第二輪擴增，擴增產物連接到T載體上進行測序。實施例2改造microRNA的專用雙鏈RNA序列的獲得根據NCBI中報道的玉米粗縮病毒病原菌-水稻黑條矮縮病毒(RiceBlack-streaked Dwarf Virus, RBSDV)基因組片段 S6 的序列(檢索號AJ409148)設計引物 primer5 :5， -AAGTTTTTTGAGTCTGAGATA-3’ (SEQ NO.42), primer6 5’-GACATCAGCTGATTTGAGTC-3’ (SEQ NO. 43)。收集受到粗縮病危害的玉米病葉，提取總RNA，總RNA提取和純化方法同實施例I中的方法。將總RNA反轉錄成cDNA，反轉錄方法同實施例1，不同之處在于，用隨機引物代替了 oligo dT引物。用cDNA做模板，以primer 5, primer 6為引物進行PCR程序,PCR反應程序為 94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C 3min，32 循環；72°C 7min。PCR 產物在瓊脂糖電泳中進行檢測，其瓊脂糖電泳圖譜如圖I所示，凝膠電泳回收并純化目的片段。將目的片段連接到T載體中，轉化感受態細胞，對陽性克隆用M13+引物進行測序，測序后得到玉米粗縮病毒病原菌基因組S6片段(如SEQ NO. 36-37所述)。將S6 片段的序列提交到軟件 wmd3 (http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp.cgi page=Home;project=stdwmd),通過和玉米全基因組序列的比對和雙鏈RNA的能量值確定專用的RNA序列，如SEQ1-34所述；詳細的具體步驟如下
(I)凝膠電泳回收并純化目的片段過程紫外燈下檢測，切下預期大小的基因片段放入I. 5mL離心管中，加入溶膠液300-700ul，55°C保溫溶解，期間不斷搖動。將含有目的基因的溶解液過柱，經過70%酒精清洗，用20ul雙蒸水洗脫。(2)目的片段連接到T載體的過程通過凝膠電泳回收并純化長度約為2645bp的目的片段，取純化產物4. Oul，加入pMD18simple T vector I. Oul 混勻，再加入 5. Oul Solution I 混勻后，16°C保溫 I 個小時以上，轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。(3)感受態細胞的制備和轉化的過程用無菌接種環挑取_70°C甘油保存的E. coli DH5 a，通過劃線稀釋的方法經37°C培養16-20h后在平板中得到DH5 a的單菌落；挑ー單菌落于5ml的LB液體培養基，180rpm振蕩培養12h ;取Iml DH5 a LB菌液于IOOml的LB液體培養基，180rpm振蕩培養到OD值
0.4 ;冰上放置15分鐘,無菌條件下倒入50ml Beckman離心管中，4°C,3500rpm離心IOmin,棄上清；沉淀用30ml冰預冷的0. IM CaCl2溶液重懸；4°C,3500rpm離心IOmin,小心倒出上清液；沉淀重懸于2ml冰預冷的含15%甘油0. IM CaCl2溶液；將這些感受態細胞按每份IOOu I分裝。將連接產物加入到感受態細胞中，稍稍混勻，冰上靜置0. 5h，42°C熱激90S，加入600ul的LB溶液，37°C搖菌復蘇lh，取IOOul均勻涂到含有抗生素的LB固體平板上，37°C培養過夜。實施例3過量表達載體的構建植物表達載體的構建過程如圖2所示根據玉米zma_MIR159a的前體序列以及專用雙鏈RNA的序列，設計引物primer7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG (SEQ NO. 44),和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG (SEQ NO. 45);其中下劃線序列為酶切位點，sequenceA和sequenceB序列為專用雙鏈 RNA 序列及其反向互補序列。如 sequenceA TCAT ACGAGCT AAAT CGACAG, sequenceB GTCGATTTAGCTCGTATGAGA。以玉米zma_MIR159a為模板,用引物primer 7和primer 8進行PCR反應。PCR反應程序為 94°C 5min;再 94°C 50s，54°C 45s, 72°C lmin，30 循環；72°C 7min。將擴增后的序列連接到T載體中，提取質粒通過Xba I和Bam HI雙酶切,連接轉化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動子的植物表達載體中。連接和轉化的過程同實施例2，詳細的具體步驟如下酶切的過程在I. 5mL 離心管中先后加入 ddH20 21. 5ul,質粒 5. Oul, Buffer K I. 5ul, Bam HI
I.Oul, Xba I I. Oul，混勻，37°C酶切過夜，電泳后回收目的片段，回收過程同實施例2。質粒提取過程(上海生エ質粒提取試劑盒):(I)取I. 5-5ml過夜培養的菌液,12, OOOrpm離心2min,收集菌體,倒盡或吸干培養基。(2)在菌體沉淀中加入250 U I Solution I，吸打或震蕩至徹底懸浮菌體。(3)加入250 ill Solution II，立即溫和顛倒離心管5_10次混勻，室溫靜置2-4min。(4)加入350lil Solution III,立即溫和顛倒離心管5-10次充分混勻。(5) 12，OOOrpm離心IOmin,將上清全部小心移入吸附柱中，8，OOOrpm離心30sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。(6)向吸附柱中加入 500 U I 漂洗液(Wash Solution), 10，OOOrpm 離心 lmin,倒掉
收集管的液體，將吸附柱放入同一收集管。(7)重復步驟(6)—次。(9)將空吸附柱和收集管放入離心機，12，OOOrpm離心2min。(10)將吸附柱放入干凈的I. 5ml離心管中，在吸附膜中央加入30-50 y I洗脫液(Elution Buffer),室溫靜置2min, 10, OOOrpm離心lmin。將所得的質粒DNA溶液置于_20°C保存或用于后續試驗。實施例4 轉化玉米優良自交系玉米幼胚的獲得和遺傳轉化取受粉后9-14d玉米優良自交系齊319的幼胚，先用70%こ醇消毒3min，再用2%(有效氯)的次氯酸鈉消毒30min，用無菌水沖洗干凈，剝取幼胚，置于固體培養基上(N6鹽，N6維生素,鹿糖20g/L,葡萄糖10g/L,脯氨酸2. 94g/L,酸解酪蛋白100mg/L, 2mg/L2，4-D，pH5. 8)上，26°C下暗培養2_3d ;轉移至高滲培養基(N6+0. 4g甘露醇)上培養4_8小時，用基因槍轟擊；轉移至高滲培養基上16-24h，然后轉移至N6培養基(N6鹽+N6維生素+鐵鹽+2. 9g/L脯氨酸+100mg/L水解酪蛋白+2. 4mg/L2, 4D+20克葡萄糖+8mg/L AgNO3)上恢復培養2-3d ;移至選擇培養基(N6+Kan)上4_6周，每兩周繼代一次；移至MSO分化培養基(MS大量鹽+MS微量鹽+N6維生素+鐵鹽+30g/L蔗糖)；經過生根和壯苗后將轉化苗移入營養缽。、
基因槍用金粉母液和子彈的制備取IOmg的金粉，用70%的こ醇洗3次，每次IOOOOrpm離心I分鐘，家Iml滅菌水振蕩2分鐘，制成10mg/ml的金粉儲存液；取300ul的金粉儲藏液，HOOOrpm離心30秒，棄上清。加入150ul的水將金粉懸浮，在振蕩器上邊輕微震蕩邊往里加入lug/ul的質粒30ul，再加入新配制的60ul的0. IM亞精胺，再加入150ul 2. 5M的CaC12，高速渦旋3分鐘，將離心管放在冰上約2分鐘讓金粉自動沉淀一會兒，lOOOOrpm離心10秒(這樣可以得到非常好的沉淀)，去掉上清，加100%酒精750ul，高速渦旋，然后將離心管放在冰上約2分鐘金粉自動沉淀一會，IOOOOrpm離心10秒,去掉上清,用300ul無水こ醇懸浮,分裝成IlOul姆管(防止揮發)，準備打槍。實施例5 :轉基因玉米苗的分子檢測提取轉基因苗的總RNA(提取方法同實施例1)，以反轉錄后的cDNA為模板，分別以I,sequence B, sequence Aノ，(primer 3, sequence A)和(sequence B, primer 4)進訂 PCR檢測。PCR程序同實施例I。實施例6 :轉基因苗的抗病性檢測通過人工接種方法對PCR檢測為陽性的TO代轉化苗(齊319，鄭58共兩個品種，每 個品種轉基因玉米幼苗各20株，對照組非轉基因玉米幼苗各20株)進行人工接種鑒定，從玉米矮縮病重病區采集發病植株，將灰飛虱在毒源上飼喂獲毒，移入帶有玉米幼苗的燒杯中飼養(循回時間12-17d，有效接種強度10-20頭/株，接種時間48-72h和玉米接種齡期2葉齡)，渡過循環期，檢測完單頭灰飛虱攜帯病原菌情況后，對轉基因玉米幼苗和非轉基因玉米幼苗進行人工接種檢測。結果表明，轉基因株系的發病率(兩個品種轉基因植株發病率均彡20%)顯著低于對照組(兩個品種非轉基因植株發病率均彡50%)，且轉基因玉米植株較對照組抗病性明顯增強。主要參考文獻李懷方.玉米矮花葉病毒(MDMV)和粗縮病毒(MRDV)研究報告匯編.中國農業大學植物病理系，1996，30-34.王朝輝.水稻黑條矮縮病毒玉米分離物的分子特性.學位論文.2004方守國，于嘉林，馮繼東等.我國玉米粗縮病株上發現的水稻黑條矮縮病毒.農業生物技術學報，2000, 8 (I) : 121-125張恒木，雷娟利，陳劍平等.浙江和河北發生的一種水稻、小麥、玉米矮縮病是水稻黑條矮縮病毒引起的.中國病毒學，2001, 16(3) :246-251秦國正，王飛.玉米粗縮病的研究進展.山東農業科學.2006(3) :17-21Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial miRNA-mediated virus resistance inplants. Journal of virology 81 1212, 6690-6699Niu Qff, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, Chua NH (2006) Expressionof artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaiiana confers virusresistance. Nat BiotechnoI. Nov;24(11):1358-1359Schwab R, Ossowski S, Riester M, et al. Highly specitic gene silencing byartificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cell, 2006, 18:1121—113權利要求
1.一種利用人工micix)RNA培育抗粗縮病玉米的專用雙鏈RNA，其特征是，它是由sequenceA 和 sequenceB 組成的雙鏈 RNA ；所述 sequenceA 如 SEQ NO. 1-34 所述；所述sequenceB的核苷酸序列是與sequenceA反向互補,或者與sequenceA小于4個堿基錯配的反向互補序列。
2.一種利用人工micix)RNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，首先克隆玉米內源的microRNA,然后以玉米內源的microRNA為模板，以分別含有如權利要求I所述的sequenceA和sequenceB的一對引物進行PCR擴增，將擴增后的序列通過酶切，連接轉化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動子的植物表達載體中；或者通過人工合成的方式，直接合成帶有權利要求I所述的sequenceA和sequenceB的人工microRNA前體序列,然后連接轉化到帶有ubiqutin或者CaMV 35S啟動子的植物表達載體中；然后將該植物表達載體通過農桿菌侵染或者基因槍的方法導入玉米中，得到抗玉米粗縮病的轉基因玉米。
3.如權利要求2所述的一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，所述玉米內源的microRNA為zma-MIR159a，所述擴增用的引物為primer 7 TGCTCTAGATCGATGCTTTGGGTTTGAAGCG-sequenceB-AGGGTCGTTCCGAAGGG,和 primer 8 CGCGGATCCGGAGGGGTGGATCAGGATG-sequenceA-GAGAGCGGCCAGCAAGGGGG ;PCR 反應程序為 94°C 5min ;再941 50s,54°C 45s, 72°C lmin，30 循環；72°C 7min。
4.如權利要求2或3所述的一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法，其特征是，所述克隆zma-MIR159a的方法是，以玉米總RNA為模板，反轉錄成cDNA ;然后以 primerl :5，-AGTTCCCTCACTCCCCAG-3，，primer2 :5，-GGACGCAACAAGCAAAAA-3’ 進行PCR 反應，PCR 反應程序為 94°C 5min;再 94°C 50s, 54 °C 45s, 72 °C lmin，30 循環；72°C7min ；以擴增后的稀釋產物為模板，以 primer3 :5_’ TCGATGCTTTGGGITTGA-3’，primer4 5’ -GGAGGGGTGGATCAGGAT-3’，以同樣的程序進行第二輪擴增，或者不進行第一輪擴增，直接用primer3和primer4進行第二輪擴增。
全文摘要
本發明公開了一種利用人工microRNA培育抗粗縮病玉米的方法及其專用雙鏈RNA。所述專用雙鏈RNA是由sequenceA和sequenceB組成的雙鏈RNA序列。首先克隆玉米內源的microRNA，然后以它為模板，以分別含有sequenceA和sequenceB的一對引物進行PCR擴增，將擴增后的序列通過酶切，連接轉化到帶有強啟動子的植物表達載體中；然后將該植物表達載體通過農桿菌侵染或者基因槍的方法導入玉米中，得到得到抗玉米粗縮病的轉基因玉米。本發明通過人工microRNA技術培育抗粗縮病玉米新種質，不容易脫靶，安全性高，而且抗病性狀可以穩定遺傳。
文檔編號A01H5/00GK102703448SQ20121014728
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月14日 優先權日2012年5月14日
發明者夏晗, 孟昭東, 李愛芹, 李長生, 畢玉平, 王興軍, 趙傳志 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心