本發明涉及一種半抗原及其制備方法和應用，尤其涉及一種多殺菌素半抗原及其制備方法和應用。

背景技術：

多殺菌素(spinosad)是從土壤放線菌刺糖多孢菌(saccharopolysporaspinosa)分離出來的一種廣譜殺蟲劑，具有殺蟲活性高，易降解、對有益生物毒性低等優點，在世界范圍內被廣泛應用于多種農作物害蟲的防治，而多殺菌素殘留超標可能會影響食品安全以及環境安全，因此迫切需要建立靈敏度高，特異性強，簡便易行的多殺菌素檢驗方法。

多殺菌素檢測方法包括高效液相色譜法、酶聯免疫測定法。高效液相色譜法精確可靠、靈敏度高，檢測極限可達到0.01μg/g，但前處理步驟多，回收率偏低。酶聯免疫測定具有靈敏度高、特異性強、對儀器設備和人員素質要求低以及樣品前處理簡單等優點，適于現場監控和大規模樣品篩選。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種多殺菌素半抗原及其制備方法和應用。

本發明的第一個方面是提供一種多殺菌素半抗原，其分子結構式為：

本發明的第二個方面是提供一種如本發明第一個方面所述的多殺菌素半抗原的制備方法，包括以下步驟：步驟1，取多殺菌素，加入0.8-1.2n硫酸(h2so4)中，75-85℃反應完全，純化，得到c-17-多殺菌素，其分子結構式如式(2)所示，其中多殺菌素、硫酸的用量比為：1g︰10-20ml；步驟2，取c-17-多殺菌素，加入二氯甲烷溶解，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶，室溫反應完全，純化，得到權利要求1所述的多殺菌素半抗原，其中，c-17-多殺菌素、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比為：600mg︰100-750mg︰12.2-122mg，

優選地，上述步驟(1)中，硫酸的濃度為1n。

優選地，上述步驟(1)中，殺菌素、硫酸的用量比為：1g︰12-18ml，更優選為1g︰15ml。優選地，上述步驟(2)中，c-17-多殺菌素、丁二酸酐和4-二甲氨基吡啶的用量比為：600mg︰400-750mg︰80-122mg，更優選為：600mg︰750mg︰122mg。

本發明的第三個方面是提供一種多殺菌素抗原，由本發明第一個方面所述的多殺菌素半抗原與載體蛋白偶聯得到，其分子結構式為：

本發明的第四個方面是提供一種制備如本發明第三個方面所述的多殺菌素抗原的方法，包括以下步驟：步驟a，取權利要求1所述的多殺菌素半抗原，加入無水二甲基甲酰胺(dmf)混勻后，加入二環己基碳二亞胺(dcc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫反應過夜，其中，多殺菌素半抗原、二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.09-0.18mmol︰0.09-0.18mmol；步驟b，離心，取溶液，將溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，所用載體蛋白的量按照半抗原與載體蛋白的摩爾比15-40︰1計；步驟c，反應完全后，透析，得到多殺菌素抗原。

優選地，上述步驟a中，多殺菌素半抗原、二環己基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.12mmol︰0.12mmol。

本發明的第五個方面是提供一種多殺菌素抗體，由本發明第三個方面所述的多殺菌素抗原免疫動物制備得到。

本發明的第六個方面是提供由本發明第五個方面所述的多殺菌素抗體制備的多殺菌素酶聯免疫試劑盒。

本發明的第七個方面是提供本發明第一個方面所述的多殺菌素半抗原或本發明第三個方面所述的多殺菌素抗原在制備多殺菌素抗體中的應用。

本發明的第八個方面是提供本發明第五個方面所述的多殺菌素抗體或本發明第六個方面所述的多殺菌素酶聯免疫試劑盒在檢測動物源性食品中多殺菌素殘留的應用。

本發明提供的多殺菌素半抗原既最大程度地保留了多殺菌素的化學結構，又通過化學合成改造引入了可以與蛋白質偶聯的-cooh，合成方法簡單，純度、產率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動物免疫的抗原體系免疫動物，所得抗體的效價、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯免疫試劑盒，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準確、快速、可同時檢測大批量的樣本，適于動物源性食品中多殺菌素殘留的現場監控和大量樣本的篩查。本發明的多殺菌素半抗原在多殺菌素的檢測中發揮重要作用。

附圖說明

圖1為多殺菌素半抗原合成路線圖。

圖2為多殺菌素半抗原核磁共振碳譜圖。

圖3為多殺菌素elisa標準曲線。

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明，而不用來限制本發明的范圍。

實施例1：多殺菌素半抗原的合成

步驟1：

稱取1g即1.37mmol多殺菌素于50ml茄型燒瓶中，溶解于30ml1n硫酸中，加熱至80℃，磁力攪拌反應，tlc板監測反應完成(展開劑為乙酸乙酯︰石油醚＝7︰3)；用50ml稀硫酸洗滌沉淀，加入30ml二氯甲烷溶解，轉移至分液漏斗，用飽和氯化鈉溶液洗滌兩次，收集有機相；用無水硫酸鈉干燥后，過濾旋干溶劑，經200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原中間體，洗脫劑為乙酸乙酯︰石油醚，體積比為7︰3，得率為71.4％。

步驟2：

稱取600mg半抗原中間體于棕色瓶中，加入750mg丁二酸酐與122.2mg4-二甲氨基吡啶，溶于20ml二氯甲烷中，室溫攪拌，tlc板監控至反應完全(展開劑為乙酸乙酯︰二氯甲烷︰醋酸＝7︰3︰0.1)；氮氣吹干后，用50ml乙酸乙酯溶解沉淀，并用飽和氯化銨溶液洗滌兩次，再用20ml乙酸乙酯反提水相，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥后，過濾旋干溶劑，經經200-300目硅膠柱層析純化得到半抗原，洗脫劑為乙酸乙酯︰二氯甲烷︰醋酸，體積比為7︰3︰0.1，得率為80％。

實施例2：多殺菌素半抗原的鑒定

取上述實施例1的產物經核磁共振氫譜和碳譜測定，核磁共振數據如下，說明半抗原合成成功：

1hnmr(500mhz,cd3od)δ7.09(s,1h),5.93(d,j＝9.8hz,1h),5.86(dt,j＝9.8,2.8hz,1h),5.03–4.95(m,1h),4.87(d,j＝1.7hz,2h),4.70–4.61(m,1h),4.34(dd,j＝12.7,7.1hz,1h),3.60–3.52(m,3h),3.52(s,3h),3.48–3.44(m,9h),3.43(t,j＝3.3hz,1h),3.35(s,6h),3.08(dt,j＝18.8,7.2hz,2h),2.98-2.96(m,1h),2.91–2.83(m,1h),2.64–2.58(m,4h),2.47(dd,j＝13.4,3.2hz,1h),2.41–2.30(m,1h),2.22–2.12(m,1h),2.04–1.93(m,1h),1.66–1.27(m,11h),1.24(d,j＝6.2hz,3h),1.09(d,j＝6.7hz,3h),0.99–0.88(m,1h),0.83(t,j＝7.5hz,3h).

13cnmr(126mhz,meod)δ203.44,175.96,173.93,173.92,150.37,145.06,130.66,129.74,97.06,83.55,82.52,78.63,77.96,77.91,76.29,69.10,61.14,59.15,57.72,51.06,49.85,47.46,46.72,42.87,42.55,38.54,37.44,35.01,33.58,31.11,30.27,29.84,29.28,22.34,18.13,16.45,9.62.

實施例3：多殺菌素抗原

向0.09mmol所述琥珀酰基多殺菌素半抗原中加入0.6ml的無水dmf，混勻后，加入0.12mmol的dcc和0.12mmol的nhs活化半抗原上的羧基基團，攪拌反應過夜后，離心去沉淀，將溶液平均分為三份，分別逐滴加入到不同的載體蛋白溶液中，所述載體蛋白為bsa，ova，klh等，所述溶解蛋白的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，所用蛋白的量按照半抗原與蛋白的摩爾比15-40︰1計算。待羧基活化的半抗原與蛋白分子上的氨基偶聯反應過夜后，將反應液轉移到半透膜中，使用10mm的ph7.2的pbs緩沖液于4℃透析3-5天，得到包被原，經紫外鑒定，多殺菌素半抗原與載體蛋白偶聯成功。將透析完畢的溶液按照所用載體蛋白的量用pbs稀釋成1mg/ml。

實施例4：抗血清制備

將1mg/ml的多殺菌素-klh或多殺菌素-bsa作為免疫原與等體積的弗氏佐劑混合攪拌乳化，首次免疫用弗氏完全佐劑，以后免疫使用弗氏不完全佐劑，每間隔10至15天對小鼠免疫一次，第三次免疫后小鼠眼眶采血檢測血清效價和抗體特異性。

實施例5：血清效價及抗體特異性檢測

將1mg/ml的多殺菌素-ova包被原使用碳酸鹽緩沖液稀釋合適的倍數后，加入到96孔酶標板中于37℃包被3小時，將多殺菌素標準品使用樣品稀釋液(pbs中含有0.1％的吐溫20和明膠)稀釋后，每孔加入50ul，以樣品稀釋液作為非抑制孔對照，隨后加入經過樣品稀釋液稀釋合適倍數的血清，于37℃溫浴30min后，洗脫，再加入羊抗鼠酶標二抗反應30min，洗脫酶標二抗后，加入含有opd或tmb的底物緩沖液顯色5-10min，于酶標儀檢測od值。

本發明以多殺菌素-ova作為包被原，多殺菌素-klh作為免疫原所獲得的抗血清，所建立的elisa標準曲線如圖3所示，抑制中濃度為287ng/ml。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。