本發明涉及免疫化學技術領域，尤其涉及一種呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用。

背景技術：

呋喃類是人工合成的一類共有5-硝基呋喃環結構的抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、部分真菌都具有抗菌效果。因價格低廉，被廣泛地應用在畜禽和魚類養殖中，用于治療由沙門氏桿菌、大腸桿菌引起的腸炎，球蟲病等，并且常作為畜牧動物以及水產魚蝦類的生長促進劑被添入飼料中。硝基呋喃類主要包括：呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮。但在食品安全中，呋喃妥因的大量或連續使用不僅對養殖動物有毒性作用，而且具有致癌、致畸、致突變作用，其代謝物還對人類健康有惡性影響。因此，許多國家已經明令禁止在飼養動物源性食品過程中使用呋喃妥因，并規定了在動物源性食品中的檢驗檢疫標準。

目前用于檢測呋喃妥因及其代謝物的方法主要有傳統的檢測方法，如分光光度法、高效液相色譜法及其聯用技術等，以上方法雖然可以精確定量，但由于設備儀器昂貴，檢測時間長，且需專業人員操作，因此無法實現真正意義上的現場檢測；以及免疫學檢測技術，此方法具有高特異性和高選擇性的特點，非常適用于復雜基質痕量組分的分離或檢測，隨著學科間的相互滲透，其檢測方法層出不窮，應用范圍亦日益擴大。與傳統檢測方法相比，免疫學檢測技術具有經濟、快速、技術要點低、操作簡便等特點。免疫分析檢測技術是近年來在環境及食品檢測等領域開發出來的一種新型快速準確檢測方法，現已逐漸成為世界各國有毒有害殘留物快速篩選檢測的主要方法之一，也為呋喃妥因的檢測提供了新的途徑。

雖然呋喃妥因代謝物本身具有活性基團，但由于其分子量較小，空間結構不突出，直接制備的人工抗原存在靈敏度低的重大不足，無法滿足現有市場的需求。因此需先通過化學方法設計出其半抗原，再進一步與載體蛋白結合獲得具有免疫原性的完全抗原。

在專利公告號為“cn200910085648.2”的專利文件中，其檢測的目標物為呋喃唑酮原料藥，但由于呋喃唑酮進入動物體內后會代謝為ahd，而ahd又對人體有巨大的傷害，因此只檢測呋喃唑酮原料藥存在重大缺陷，無法滿足市場要求。

在專利公告號為“cn200810019047.7，cn201210049810.7，cn201210098138.0”的專利文件中，其設計的半抗原結構為傳統的4-cp衍生物結構，均無法保留其待測目標物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。

在專利公告號為“cn201410593519.5”的專利文件中，其設計的半抗原結構無法保留硝基端，而且半抗原與ahd之間是通過磺酰胺鍵連接，與苯環不共軛，使半抗原的電子云密度與檢測的目標物差異大，降低了靈敏度。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是克服傳統的ahd半抗原無法完整保留競爭物特征結構的缺陷，提供一種呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原、人工抗原的制備方法及其應用，其可保留競爭物硝基端的半抗原，人工抗原，提高競爭物的特異性。

為達到上述目的，本發明提供技術如下：一種呋喃妥因代謝物的半抗原，為如下結構式ⅲ：

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃妥因代謝物的半抗原的制作方法，步驟如下：

(a)將化合物ⅰ溶解于乙醇中，所得溶液通過添加6mol/l的氫氧化鋰溶液將ph值調至10-11，反應獲得化合物ⅱ；

所述化合物ⅰ的結構式如下：

所述化合物ⅱ的結構式如下：

(b)將所述化合物ⅱ與呋喃妥因代謝物在甲醇條件下反應，既得所述呋喃妥因代謝物的半抗原；其為如下結構式ⅲ：

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃妥因代謝物的半抗原的制作方法，步驟如下：

(a’)將化合物ⅰ溶于乙醇中，所得溶液通過加入6mol/l的氫氧化鋰溶液將ph值調至10-12，室溫反應15～26h，加入純化水，所得溶液通過1m的稀鹽酸調將ph值調至4-5，過濾得到化合物ⅱ，所述化合物ⅰ反應生成所述化合物ⅱ的過程如下：

(b’)將所述化合物ⅱ溶解于甲醇中，加1.2-1.5摩爾當量的呋喃妥因代謝物ahd，于60～70℃反應2h，反應完畢，過濾，既得所述呋喃妥因代謝物的半抗原，所述半抗原的結構式ⅲ及合成路線如下：

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃妥因代謝物的人工抗原，是載體蛋白和所述的呋喃妥因代謝物的半抗原偶聯得到的偶聯物，其結構式iv為：

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一種呋喃妥因代謝物的人工抗原的制備方法，步驟如下：

(1)取所述呋喃妥因代謝物的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，所述半抗原、碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺的重量比為5：4：3，室溫下攪拌4-8h，即得半抗原活化酯；

(2)稱取載體蛋白，所述載體蛋白與所述半抗原的摩爾當量比為30：1，使所述載體蛋白充分溶解在0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將所述半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至所述載蛋白溶液中，并在室溫下攪拌16-24h；

(3)將步驟(2)所得溶液在0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液；

(4)分裝，于4℃保存備用。

其中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白(bsa)，卵清蛋白(ova)，人血清白蛋白(has)或血藍蛋白(klh)中的任意一種。

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，一致呋喃妥因代謝物的單克隆抗體的制備方法，步驟如下：

(i)以呋喃妥因代謝物的人工抗原為免疫原，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫balb/c小鼠，每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次；

(ii)采步驟(i)處理后的小鼠尾部靜脈血檢測血清效價，如抗體效價不達60000，需加強免疫，待抗體效價不再升高后，以100μg免疫原進行皮下加強免疫，5天后取小鼠的脾細胞與sp20細胞融合；

(iii)融合后的細胞在hat培養基中篩選，5天后以完全培養基替換成hat培養基進行培養；

(iv)用elisa對步驟(iii)處理后的細胞上清進行檢測，將檢測結果為強陽性的孔內細胞進行有限稀釋法克隆培養，經3次克隆培養檢測后，均呈陽性的孔內細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞；

(v)將所述雜交瘤細胞放大培養后，接種至小鼠腹腔，產生含抗體的腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即得。

所述制備方法可得到高純度、高特異性的單克隆抗體，所述單克隆抗體在檢測水產品中呋喃妥因代謝物殘留分析中應用。

本發明解決該技術問題所采用的另一技術方案是，呋喃妥因代謝物的人工抗原和呋喃妥因代謝物的單克隆抗體在檢測呋喃妥因代謝物ahd中的應用，將所述的呋喃妥因代謝物的人工抗原作為包被原包被在酶標板上，將所述的呋喃妥因代謝物的單克隆抗體加入微孔板中；采用競爭法檢測待檢樣本中呋喃妥因代謝物ahd的含量。

與現有技術相比，具有如下積極效果：傳統方案的ahd半抗原結構均無法保留待測物的硝基端，使得半抗原、抗原制備獲得的抗體均存在特異性差、親和力低等不足。本發明中提供了一種新型ahd衍生物半抗原，以及基于該半抗原制備的一種人工抗原，闡述了兩者的制備方法與應用。其思路是將ahd衍生化，獲得具有活性基團和雙鍵剛性支撐手臂的衍生物，同時還完整的保留了ahd衍生物的特征結構，對其電子云密度無影響，同時為了增強半抗原的免疫原性制備出高質量的抗體，該抗體可以特異性識別ahd衍生物。

該思路的有益效果體現在：(1)引入具有剛性支撐作用的雙鍵手臂，使得ahd的結構特征明顯增強，利于決定簇的良好呈現；(2)制備的半抗原完整的保留了ahd衍生物的特征結構，對其電子云密度無影響，使得小分子半抗原的免疫原性明顯增強，有利于刺激動物免疫應答產生特異性更強、靈敏度更高的抗體；(3)本發明提供的ahd的快速檢測方法最低檢測限可達0.05ng/g。

下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明。

附圖說明

圖1是本發明的呋喃妥因代謝物的半抗原的合成路線。

圖2是本實施例1中化合物ⅱ的esi-ms圖譜。

圖3是本實施例1中化合物ⅱ的核磁共振氫譜圖譜。

圖4是本實施例1中呋喃妥因代謝物的半抗原的esi-ms圖譜。

圖5是本實施例1中呋喃妥因代謝物的半抗原的核磁共振氫譜圖譜。

圖6是本實施例4中呋喃妥因代謝物的人工抗原為免疫原制備的抗體建立的對ahd衍生物的抑制曲線。

具體實施方式

實施例1

如圖1-5所示，本實施例1的呋喃妥因代謝物ahd衍生化半抗原通過以下方法制備，步驟如下：

(a’)將2.0g(即7.1mmol)的化合物ⅰ溶于10ml的乙醇中，加入6mol/l的氫氧化鋰溶液，將化合物ⅰ的乙醇溶液調至ph值為10-12，室溫反應15～26h，加入40ml純化水，所得溶液用1m的稀鹽酸調ph值至4～5，過濾，烘干得到1.1g的化合物ⅱ。

esi-ms：167[m-ch2ch2ch2cooh-1]，252[m-1]，288[m+2h2o-1]，315[2×167-h2o-1]，505[2m-1]，537[2m+meoh-1]；

1hnmr(600mhz，cdcl3，tms)：δ10.50(s，1h)，8.20(d，1h)，7.35(d，1h)，7.15-7.19(dd，1h)，4.23(t，2h)，2.66(t，2h)，2.26(m，2h)。

(b’)將0.5g(即2.0mmol)的化合物ⅱ溶解于10ml甲醇中，加入0.27g(即2.4mmol)的呋喃妥因代謝物ahd，于60～70℃反應2h，反應完畢，冷卻至室溫，過濾，得0.26g的呋喃妥因代謝物的半抗原，所述半抗原的結構式ⅲ及其合成路線見圖1。

esi-ms：351[m+1]；

1hnmr(600mhz，dmso，tms)：δ11.39(s，1h)，8.16(t，2h)，7.40(d，1h)，7.22(dd，1h)，4.37(s，2h)，4.19(t，2h)，2.42(t，2h)，2.04(m，2h)。

實施例2

本實施例2是呋喃妥因代謝物的人工抗原，所述人工抗原包括免疫原與包被原，兩者的不同之處在于制備過程中偶聯的載體蛋白種類不同，所述免疫原采用實施例1制備的半抗原，載體蛋白采用牛血清蛋白(bsa)；所述包被原采用實施例1制備的半抗原，載體蛋白采用卵清蛋白(ova)。

本實施例2的呋喃妥因代謝物的包被原，通過以下方法制備，其步驟依次如下：

(1)取10.0mg實施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入8.0mg碳二亞胺(edc)和6.0mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2)稱取38.1mg的卵清蛋白(ova)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌24h；

(3)步驟(2)制得的溶液用0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；

(4)分裝，于4℃保存備用。

其中，實施例1的半抗原與卵清蛋白(ova)的摩爾比為30：1。

本實施例2的呋喃妥因代謝物的免疫原，通過以下方法制備，其步驟依次如下：

(1’)取10.0mg實施例1的半抗原，溶解于0.5ml二甲基甲酰胺(dmf)中，攪拌充分后，加入8.0mg碳二亞胺(edc)和6.0mg的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，室溫下攪拌4h，即可得到半抗原活化酯；

(2’)稱取62.8mg的牛血清白蛋白(bsa)，使其充分溶解在4ml的濃度為0.01mol/l的pbs溶液中，形成載體蛋白溶液，在攪拌下將半抗原活化酯逐滴緩慢滴加至載體蛋白溶液中，并在室溫下攪拌24h；

(3’)步驟(2’)制得的溶液用0.01mol/l的pbs溶液室溫透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；

(4’)分裝，于4℃保存備用。

其中，實施例1的半抗原與牛血清白蛋白(bsa)的摩爾比為30：1。

其中，以下提及的免疫原式(ⅲ)-bsa即為本實施例2的呋喃妥因代謝物，包被原式(ⅲ)-ova即為本實施例2的呋喃妥因代謝物。

實施例3

本實施例3的呋喃妥因代謝物的單克隆抗體，通過以下方法制備，其步驟為：

將實施例2制備的免疫原式(ⅲ)-bsa，與等體積弗氏佐劑乳化后，免疫balb/c小鼠。每只鼠免疫劑量為50～100μg，免疫間隔3周，免疫3次后，采小鼠尾部靜脈血檢測血清效價。如抗體效價不達60000，需加強免疫，待抗體效價不再升高后，以100μg免疫原進行皮下加強免疫，5天后取小鼠的脾細胞與sp20細胞融合。融合后的細胞在hat培養基中篩選，5天后以完全培養基替換成hat培養基進行培養。用elisa對細胞上清進行檢測，將檢測結果為強陽性的孔內細胞進行有限稀釋法克隆培養，經3次克隆培養檢測后，均呈陽性的孔內細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。將雜交瘤細胞放大培養后，接種至小鼠腹腔，產生含抗體的腹水。用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水，即可得到高純度、高特異性的單克隆抗體。

elisa間接競爭法測定抗體陽性滴度以3倍于陰性血清的測定值為準，結果表明包被原式(ⅲ)-ova對應的抗血清(ab-式(ⅲ))效價為1：72000。

實施例4

單克隆抗體的特異性及靈敏度。

4.1酶標板的制備方法

用ph9.6的碳酸鹽緩沖液作包被稀釋液，將實施例2制備的式(ⅲ)-ova稀釋至0.2μg/ml，按100μl/孔加入聚苯乙烯微孔板中，4℃包被過夜，甩干，按250μl/孔加入含1％bsa，磷酸鹽緩沖液中37℃封閉1h，甩干，干燥后真空包裝保存。

4.2抗體的配制

用含0.05％疊氮鈉，ph7.4的磷酸鹽緩沖液，將實施例3制備的單克隆抗體稀釋至0.05μg/ml，4℃保存。

4.3標準溶液的配制

呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標準溶液為精確稱量呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標準品10mg，先用dmf和純化水各1ml溶解，再用ph7.4的磷酸鹽緩沖液配制系列濃度為0μg/l，0.05μg/l，0.15μg/l，0.45μg/l，1.35μg/l，以及4.05μg/l的呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標準溶液。

4.4評價結果

向包被有(ⅲ)-ova的微孔酶標板中加入呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標準溶液50μl/孔，再加入配制好的單克隆抗體溶液50μl/孔，37℃反應0.5h；甩干后，加入洗液300μl/孔，洗滌3次后拍干；再加入酶標二抗100μl/孔，37℃反應0.5h；再次洗滌3次后拍干，分別加入50μl/孔的顯色液a和顯色液b，37℃反應15min；加入2m硫酸50μl/孔終止，設定酶標儀于450nm波長測定每孔的od值。結果如表1和圖6。

表1：elisa測試不同濃度呋喃妥因代謝物ahd的衍生物標準品od值

其中，b/b0是指不同濃度的標準品測試孔od值與含量為0的標準品測試孔od值的比值。從表1中可看出，當呋喃妥因代謝物ahd的衍生物含量為0.05μg/l時，其b/b0值為74.54％，說明其檢測od與含0μg/l濃度的呋喃妥因代謝物ahd的衍生物測試孔od值有明顯差異，故elisa對呋喃妥因代謝物ahd的衍生物檢測靈敏度均可達0.05μg/l。

本發明采用的試劑和儀器及其它術語參見現有技術及公知常識。

本發明并不局限于上述實施方式，如果對本發明的各種改動或變型不脫離本發明的精神和范圍，倘若這些改動和變型屬于本發明的權利要求和等同技術范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型。