本發明涉及一株對稻瘟病具有強抑制作用的黑曲霉及其應用，主要應用于稻瘟病生物防治的研究。
背景技術：
：生物防治(biologicalcontrol)，指利用有益生物或者其他生物來抑制或者消滅有害生物的一種防治方法。常見的生物防治方法包括微生物源農藥、植物源農藥。水稻稻瘟病是世界性的稻病，同紋枯病、白葉枯病一起被列為水稻三大病害。由稻瘟病引起的糧食損失，嚴重制約了水稻的發展。目前防治稻瘟病和紋枯病的方法主要包括化學防治、生物防治和栽培管理。化學防治見效快、成本低，但是容易導致環境污染、人畜中毒、病原菌產生抗性。生物防治對人畜無毒、不污染環境、效果持久，具有防治病害的新前景。黑曲霉，子囊菌亞門，絲孢目，叢梗孢科中的一個常見種。自中伸出，直徑15～20pm，長約1～3mm，黑曲霉壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀,直徑2.5～4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗。分生孢子褐色球形。廣泛分布于世界各地的、性產品和中。是重要的發酵工業菌種。本發明在疏花水柏枝內生真菌分離過程中得到一株黑曲霉，它具有很強的稻瘟病抑制作用，而且其發酵液對稻瘟病菌也有很強的抑制作用，可用于制備稻瘟病殺菌劑，為開發新的稻瘟病生防菌和殺菌劑提供了新選擇。技術實現要素：本發明的目的之一是提供一種黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株，該黑曲霉具有很強的稻瘟病拮抗作用，而且其發酵液對稻瘟病也有很強的抑制作用，可用于制備稻瘟病殺菌劑，為開發新的稻瘟病生防菌和殺菌劑提供了新選擇。所述黑曲霉(aspergillusniger)js-1是在疏花水柏枝(myricarialaxiflora)的內生真菌分離過程中得到，于2017年1月11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為，cctccm2017024。保藏地址為中國，武漢，武漢大學。本發明黑曲霉(aspergillusniger)js-1在馬鈴薯葡萄糖培養基上具有以下微生物學特性：10-12小時有白色菌絲，20-24小時白色菌絲產黑色孢子，5天后基本都是黑色的孢子，看不到菌絲，孢子表面較干燥，在馬鈴薯葡萄糖液體培養基上具有以下微生物學特性：3天左右，為白色菌團，4天左右培養基液面有少量黑色孢子生成。本發明目的是提供一種用于生物防治植物病害的菌劑和生物農藥，其活性成分為黑曲霉(aspergillusniger)js-1。其中所述植物病害為水稻稻瘟病。抑菌試驗表明，黑曲霉js-1對稻瘟病病原菌具有抑制效果。本領域技術人員很容易想到將本發明菌株的發酵液或菌懸液作為農藥的有效成分用于植物病害的生物防治，或者將本發明菌株制備成菌劑用于植物病害的生物防治。因而，本發明還包括含有所述菌株或者其發酵液的生物農藥，以及含有所述菌株的微生物菌劑。本發明以黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株為模板，使用通用上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′進行pcr擴增獲得750bp的18srdna部分序列。通過blast與genbank收錄的序列進行比對，發現js-1與黑曲霉的同源性為99％。用mega4.1進化樹(圖4)，鑒定菌株(js-1)與一株黑曲霉(aspergillusnigerkf768466)的同源性達99％。附圖說明圖1為本發明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1的菌落形態，a為黑曲霉(aspergillusniger)js-1pda平板正面照片；b為黑曲霉(aspergillusniger)js-1pda平板背面照片。圖2為本發明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1的顯微形態。圖3為本發明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌體的稻瘟病抑菌活性的照片，在pda平板中央接種7mm稻瘟病菌種，培養5天后，在距平板中央3cm處用7mm打孔器打孔并接入黑曲霉(aspergillusniger)js-1孢子懸液，再培養4天。a為正面照片；b為背面照片。圖4為黑曲霉(aspergillusniger)js-1發酵液粗提物在pda平板上對稻瘟病菌抑制圖，c為正面照片；d為背面照片，圖中上牛津杯為清水空白對照，下為發酵液粗提物。圖5為正常生長7天稻瘟病菌在pda平板上的照片，e為正面照片；f為背面照片。圖6為本發明的黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株的18srdna系統發育樹。具體實施方式實施例一：黑曲霉(aspergillusniger)js-1的分離和保存2012年在三峽流域湖北宜昌境內胭脂壩采集疏花水柏枝葉片，消毒后進行分離純化過程中獲得；分離純化：將處理好的樣品接種到pda(新鮮土豆200g/l，蔗糖20g/l，瓊脂20g/l，其余為水，ph7.2-7.5，121℃滅菌20min)固體培養基(加濃度為25μg/ml的青霉素抑制細菌和放線菌生長)上，置于28℃恒溫培養箱中培養，當樣品周圍明顯長出菌絲時，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌株，轉入到pda固體培養基中，連續接代幾次，得到純化菌株。培養：取純化好的菌株，接種到pda固體平板培養基上，恒溫箱內28℃培養，4天左右即可長滿平板。采用石蠟保藏法，在滅菌的試管中倒入pda固體培養基制成斜面，接種菌落單一的js-1，恒溫箱內28℃培養，待斜面長滿后，加入滅菌的石蠟使之淹沒斜面的高度即可，于4℃冰箱保存。將該菌株黑曲霉(aspergillusniger)進行保藏，保藏名稱為js-1；保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址為中國，武漢，武漢大學；保藏日期：2017.1.11；保藏編號為，cctccm2017024。實施例二：黑曲霉(aspergillusniger)js-1鑒定18srdna序列分析：采用通用引物進行pcr擴增18srdna序列。上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。反應體系如下：反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，55-58℃退火30s，72℃延伸1.5min，33個循環，最后72℃延伸10min。pcr產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑取750bp左右的條帶進行凝膠回收，送上海生工測序。將測得的序列提交至genbank，并獲得登錄號kx822145。將此序列在genbank中進行blast比對，并選取同源性較高的菌株的序列用mega4.1軟件構建18srdna系統發育樹。實施例三：黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌體的制備菌種活化：取保存4℃冰箱的黑曲霉(aspergillusniger)js-1，挑起少許菌體接種于pda固體平板培養基中，28℃下，培養4天。實施例四：黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌體對稻瘟病的抑菌作用研究1、菌體抑菌作用研究將稻瘟病菌7mm菌餅放置在pda平板中心，27℃倒置培養5天；再將黑曲霉(aspergillusniger)js-1菌株孢子懸液打入平板上對峙三點，清水為對照，置于恒溫培養箱27℃培養.2、發酵液對稻瘟病在pda平板上抑菌作用研究通過真空抽濾裝置過濾菌懸液，棄去菌體，把發酵液上清液用等體積的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，將萃取液于40℃條件下減壓濃縮獲得濃縮液，之后將濃縮液冷凍干燥獲得粗提取物。將黑曲霉(aspergillusniger)js-1的發酵液粗提取物稀釋4倍配成溶液，將稻瘟病菌7mm菌餅放置在pda平板中心，再將黑曲霉(aspergillusniger)js-1的發酵液粗提取物溶液打入50μl溶液于平板上一側牛津杯中，另一側牛津杯中加入清水作為空白對照，重復3次。3、發酵液粗提物對稻瘟病在土豆液體培養基上抑菌作用研究將稻瘟病菌接種在裝有200ml液體土豆培養基的搖瓶中連續發酵一周，制成種子培養基。再搖勻種子培養基后，取5ml接種到裝有200ml液體土豆培養基的搖瓶中，接種6瓶，標號為1,2,3,4,5,6瓶；1、2號瓶中分別加入清水0.5ml、1.0ml為空白對照；3、4號瓶中分別加入黑曲霉(aspergillusniger)js-1的發酵液粗提取物0.5ml為實驗組一；5、6號瓶中分別加入黑曲霉(aspergillusniger)js-1的發酵液粗提取物1.0ml為實驗組二。在27℃，搖床轉速120r/min下連續培養8天，過濾菌體，放入烘箱中105℃過夜，測稻瘟病菌干重。黑曲霉(aspergillusniger)js-1發酵液粗提物對稻瘟病在土豆液體培養基上抑菌作用數據如下表：粗提物加入量/ml00.51稻瘟病菌干重/g1.1060.7330.841序列表seqidno：1js1544bpaspergillusniger黑曲霉菌cttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaccgagtgcgggtcctttgggcccaacctcccatccgtgtctattataccctgttgcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaacat。當前第1頁12