本發(fā)明屬于植物促生菌開(kāi)發(fā)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及的是一種地衣芽孢桿菌菌株ta65及其在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：化肥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大作用。但是隨著化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。農(nóng)藥和化肥的殘留，向環(huán)境釋放了大量的有害物質(zhì)，污染了土壤、水源和食品，對(duì)人類健康及生存環(huán)境構(gòu)成了極大威脅，要求保護(hù)生態(tài)環(huán)境和生產(chǎn)安全食品的呼聲日益強(qiáng)烈。因此，開(kāi)發(fā)利用替代化學(xué)肥料的新肥源，以適應(yīng)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和綠色食品的需要已是當(dāng)務(wù)之急。而微生物肥料可使土壤中無(wú)效營(yíng)養(yǎng)有效化，預(yù)防和控制農(nóng)作物病害，減少農(nóng)藥和化肥的使用，是解決土壤、水源和食品污染的根本途經(jīng)，被普遍認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效的提高作物產(chǎn)量的方法。微生物肥料是一類含有微生物活體的特定制品，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。其中制品中活微生物起關(guān)鍵作用。目前，一般將微生物肥料制品分為兩大類：一類是狹義的微生物肥料，指通過(guò)微生物的生命活動(dòng)，增加了植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)量，包括土壤和生產(chǎn)環(huán)境中植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)總量，導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)狀況的改善，進(jìn)而增加產(chǎn)量。這一類微生物肥料的代表是根瘤菌肥；另一類是廣義的微生物肥料，指通過(guò)其中微生物的生命活動(dòng)，不但能提高植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)量，還能產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲(chóng)害簡(jiǎn)介提高作物產(chǎn)量。與化學(xué)肥料相比，微生物肥料具有以下優(yōu)點(diǎn)：不破壞土壤結(jié)構(gòu)；保護(hù)生態(tài)、不污染環(huán)境，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害；肥效持久；提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)；成本低廉，經(jīng)濟(jì)有效。植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，pgpr)是一類能高密度定殖在植物根際的微生物，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進(jìn)植物生長(zhǎng)并增加作物產(chǎn)量的作用。作為生物肥料和生物農(nóng)藥的重要資源庫(kù)，pgpr的研究和應(yīng)用已經(jīng)起到了舉足輕重的作用。從資源再生利用的角度來(lái)研究和開(kāi)發(fā)微生物肥料則對(duì)資源綜合利用和環(huán)境保護(hù)更具有現(xiàn)實(shí)意義。地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)，其細(xì)胞形態(tài)和排列呈桿狀、單生，可調(diào)整菌群失調(diào)達(dá)到治療目的，可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌。能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，并具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖。地衣芽孢桿菌主要應(yīng)用以下幾個(gè)方面：(1)有效預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物腸炎，爛鰓等疾病。(2)分解養(yǎng)殖池中的有毒有害物質(zhì)，凈化水質(zhì)。(3)具有較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促進(jìn)飼料中營(yíng)養(yǎng)素降解，使水產(chǎn)類動(dòng)物對(duì)飼料的吸收利用更加充分。(4)刺激水產(chǎn)動(dòng)物免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。(5)促進(jìn)腸道內(nèi)正常生理性厭氧菌的生長(zhǎng)，調(diào)整腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道功能；(6)對(duì)腸道細(xì)菌感染具有特效，對(duì)輕型或重型急性腸炎，輕型及普通型的急性菌痢等，均有明顯療效；(7)能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，并具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長(zhǎng)繁殖。目前，地衣芽孢桿菌主要用作動(dòng)物飼料添加劑，而對(duì)于地衣芽孢桿菌在促進(jìn)堆肥腐熟中應(yīng)用尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。公開(kāi)于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種地衣芽孢桿菌菌株ta65，該菌株可應(yīng)用于制備表面活性劑及促進(jìn)堆肥腐熟。本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明公開(kāi)了一種地衣芽孢桿菌菌株ta65，其分類學(xué)命名為地衣芽孢桿菌a65(bacilluslicheniformis)，于2017年01月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為cgmcc13531。本發(fā)明還提供了所述的地衣芽孢桿菌菌株ta65在降解木質(zhì)纖維素中的用途。本發(fā)明還提供了所述的地衣芽孢桿菌菌株ta65在制備表面活性劑中的用途。本發(fā)明還提供了所述的地衣芽孢桿菌菌株ta65在制備漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、錳過(guò)氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶中的用途。本發(fā)明還提供了一種菌劑，將權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌菌株ta65種子液按1％(v/v)的接種量，接種到1l滅菌后的lb培養(yǎng)液中，在搖床(50℃，120rmp)中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液，即得菌劑。本發(fā)明還提供了所述的菌劑在促進(jìn)堆肥腐熟中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：1.本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌菌株ta65為首次從堆肥高溫期樣品中篩選分離得到的，該菌株耐高溫，生長(zhǎng)繁殖快，且能夠產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶。2.本發(fā)明提供的含地衣芽孢桿菌菌株ta65的菌劑能夠提高堆肥溫度，加速有機(jī)質(zhì)降解生成小分子水溶有機(jī)質(zhì)(dom)，提高凱氏氮的含量，促進(jìn)堆肥腐熟。3.本發(fā)明提供的地衣芽孢桿菌菌株ta65還具有產(chǎn)生物表面活性劑的功能，因此，該菌株可以用于制備表面活性劑。保藏信息說(shuō)明地衣芽孢桿菌a65(bacilluslicheniformis)，保藏編號(hào)為cgmcc13531，保藏日期為2017年01月05日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。附圖說(shuō)明圖1為溫度隨堆肥時(shí)間變化曲線。rt：室溫，空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖2為ph隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖3為水分隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖4為有機(jī)質(zhì)含量隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖5為凱氏氮含量隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖6為氨氮含量隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖7為硝態(tài)氮含量隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖8為dom含量隨堆肥時(shí)間變化曲線。空白組(ck)，實(shí)驗(yàn)組(t)圖9為bacilluslicheniformista65菌落圖。圖10為bacilluslicheniformista65在血瓊脂平板上的表現(xiàn)。圖11為葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖12為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖13為篩選出菌株的凝膠電泳圖譜；有關(guān)附圖標(biāo)記的說(shuō)明：m-2000bpmake；1-tb21；2-tb22；3-tb23；4-tb24；5-tb25；6-tb41；7-tb42；8-tb43；9-tb44；10-tb45；11-tb61；12-tb62；13-tb63；14-tb64；15-tb65；16-ta65；17-tb46。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。下述實(shí)施例中所用的材料和試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1：地衣芽孢桿菌a65(bacilluslicheniformis)的篩選1.實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1.1主要試劑表1主要試劑1.2主要儀器與設(shè)備表2主要儀器與設(shè)備儀器名稱型號(hào)生產(chǎn)廠家紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)uv759上海精科潔凈工作臺(tái)sw-cj-1f蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司自動(dòng)平衡離心機(jī)psz4-1.2北京市醫(yī)用離心機(jī)廠雷偌ph計(jì)phs-2s上海儀電儀器股份有限公司恒溫?fù)u床hq45z武漢中科科技技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司生化培養(yǎng)箱spx-150b上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐dk-98-ii天津市泰斯特儀器有限公司冰箱電子天平y(tǒng)p6102上海光正醫(yī)療儀器有限公司電熱干燥箱立式壓力蒸汽滅菌器yxq-ls-50sii上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠電熱恒溫水浴鍋北京市醫(yī)療設(shè)備廠精密電子天平j(luò)j500y1.3培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂33g，去離子水1000ml；lb培養(yǎng)液：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，去離子水1000ml。2.木質(zhì)素降解菌的分離篩選2.1取樣篩菌的樣品分別為2、4、6天的堆肥樣品，在堆體溫度較高處多點(diǎn)取樣(一般在堆體表面下方10-20cm)，樣品混勻后裝入樣品袋中于-4℃的冰箱里保存。2.2耐高溫菌的篩選及純化稱取樣品10g，加入到含有90ml滅菌處理后的nacl溶液(0.9％w/v)的三角瓶中，置于搖床上振蕩30min，目的是打散菌膠團(tuán)，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于溶液中。將滅菌處理后的nacl溶液分別加到7支試管中(同樣滅菌處理過(guò))，每支加入9ml,取震蕩后的菌液1ml分別加入試管，即分別稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再分別將各稀釋度下的菌液取0.1ml涂布在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，50℃恒溫培養(yǎng)。每種稀釋梯度的平板均作5個(gè)平行。可以觀察到細(xì)菌群落在10-5稀釋度下長(zhǎng)勢(shì)較好。在五個(gè)平行平板中選取菌落較大的進(jìn)行分離培養(yǎng)并多次劃線純化。如圖9-10所示，地衣芽孢桿菌a65菌落形態(tài)較規(guī)則，菌落較小，表面粗糙干燥，邊緣濕潤(rùn)，白色，菌落邊緣較整齊。3.粗酶液的制取配制lb培養(yǎng)液，滅菌處理，倒入同樣滅過(guò)菌的血清瓶中(25ml)，把分離得到的株菌接種到血清瓶中，放入搖床(50℃，120rmp)培養(yǎng)，制備種子液。配制lb培養(yǎng)液，在錐形瓶中倒入100ml，滅菌處理，吸取上述1ml種子液到錐形瓶中，同樣放入搖床培養(yǎng)(50℃，120rmp)，制成菌液。液體產(chǎn)酶培養(yǎng)：菌液經(jīng)5000r/mim離心5min，取上清液作為粗酶液，以熱滅活酶液(取0.6ml粗酶液于離心管，煮沸10min)作為對(duì)照。4.酶活的測(cè)定方法4.1漆酶(lac)活性的測(cè)定1、試劑(1)由該酶氧化abts的速度決定；(2)0.1mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液:分別稱取2.941g檸檬酸鈉和2.1014g檸檬酸，加去離子水100ml，向檸檬酸鈉中加檸檬酸，用ph計(jì)調(diào)ph＝5.0；(3)0.5ml0.5mol/labts；2、操作步驟(1)在25℃時(shí)，在試管中加入2ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1mmol/l，ph＝5)，和0.5mlabts，將混合液倒入比色皿中；(2)然后添加1ml酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，在420nm下測(cè)定吸光值變化。3、計(jì)算方法酶活定義：為每分鐘氧化1μmol的abts為一個(gè)酶活單位，消光系數(shù)ε＝3.6*104[(mol/l)-1cm-1]，酶活單位：u/l漆酶(lac)活力＝aod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/0.5*3.6*104式中：δod-測(cè)定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對(duì)應(yīng)的時(shí)間差值；v-酶液的體積。4.2木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(lip)活性的測(cè)定1、試劑(1)0.24mol/l酒石酸鈉緩沖液：分別稱取3.60216g酒石酸和5.52192g酒石酸鈉，加去離子水100ml，向酒石酸鈉中加酒石酸，調(diào)ph＝3.0；(2)0.1ml24mmol/l藜蘆醇；(3)0.05ml6.0mmol/l的h2o2；2、操作步驟(1)在37℃時(shí)，總反應(yīng)體系為3ml，向試管中加入1.85ml0.24mol/l酒石酸鈉緩沖液(ph＝3.0)，和0.1ml24mmol/l藜蘆醇和1.0ml酶液；(2)預(yù)熱至37℃將溶液倒入比色皿，然后再添加0.05ml6.0mmol/l的h2o2啟動(dòng)反應(yīng)，在波長(zhǎng)為310nm下測(cè)定吸光值變化。3、計(jì)算方法酶活定義為每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇為一個(gè)酶活單位，消光系數(shù)ε＝9.3*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活單位：u/l過(guò)氧化物酶(lip)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*9.3*103式中：δod-測(cè)定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對(duì)應(yīng)的時(shí)間差值；v-酶液的體積。4.3錳過(guò)氧化物酶(mnp)活性的測(cè)定1、試劑(1)0.11mol/l的乳酸鈉緩沖液：稱取1.10098g乳酸和2.05516g乳酸鈉，分別加去離子水100ml,向乳酸鈉中加乳酸，調(diào)ph＝4.5；(2)0.025ml40mmol/l硫酸錳；(3)0.025ml1.6mmol/l的h2o2；2、操作步驟(1)根據(jù)酶在h2o2存在下把mn2+氧化mn3+的速度來(lái)決定；(2)總反應(yīng)體積為1ml，向試管中加入0.85ml0.11mol/l的乳酸鈉緩沖液(ph＝4.5)再加入0.025ml、40mmol/lmnso4和1ml的酶液；(3)預(yù)熱37℃后，將溶液倒入比色皿，在比色皿中添加0.025ml1.6mmol/l的h2o2啟動(dòng)反應(yīng)，在240nm下測(cè)定吸光值變化。3、計(jì)算方法酶活的定義為每分鐘氧化1μmol的mn2+為mn3+為一個(gè)酶活單位，消光系數(shù)ε＝6.5*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活單位：u/l錳過(guò)氧化物酶(mnp)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*6.5*103式中：δod-測(cè)定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對(duì)應(yīng)的時(shí)間差值；v-酶液的體積。4.4纖維素酶活性的測(cè)定1、試劑(1)0.1mol/l檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液：分別稱取2.941g檸檬酸鈉和2.1014g檸檬酸，加去離子水100ml，向檸檬酸鈉中加檸檬酸，用ph計(jì)調(diào)ph＝4.8；(2)1.5mldns；(3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：1.0000g葡萄糖溶于1000ml的去離子水配制成1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。2、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線制作取1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液各0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml于試管中，補(bǔ)加去離子水至2.0ml，再加入2.0mldns試劑，具塞，沸水浴10min，冷卻后定容至15ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為550nm下測(cè)od值，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取均值制圖，葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖11。由光密度值引得葡萄糖量。3、操作步驟(1)向試管中加入1cm*2cm的whatmanno1定量試紙，再加入1.0cm檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液(0.1mol/l,ph＝4.8)以及0.5ml酶液；(2)在50℃下保溫1h，然后取出加入1.5mldns終止反應(yīng)，再?gòu)U水浴5min后流水冷卻，定容至25ml；(3)在540nm下測(cè)定其吸光度。4、計(jì)算方法纖維素酶活力＝y(tǒng)*1000ug/v酶液/t,其中y由標(biāo)曲得到y(tǒng)＝0.6916x式中：x-測(cè)定的吸光度值；t-水浴的時(shí)間；v酶液-酶液的體積。4.5半纖維素酶活性測(cè)定1、試劑(1)1.8ml1％的木聚糖溶液：用木聚糖以ph＝4.8醋酸緩沖液配成1％溶液；(2)1.8ml醋酸緩沖液：稱取0.82g乙酸鈉，量取0.6ml乙酸，分別加去離子水100ml，向乙酸鈉中加乙酸，調(diào)ph＝4.8；(3)2mldns；(4)木糖標(biāo)準(zhǔn)液：1.0000g木糖溶于1000ml的去離子水配制成1mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)液。2、木糖曲線制作取1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于試管中，補(bǔ)加去離子水至2.0ml，再加入2.0mldns試劑，具塞、沸水浴10min，冷卻后定容至15ml，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為550nm下測(cè)od值，3次重復(fù)試驗(yàn)，取均值制圖，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參見(jiàn)圖12。由光密度值引得木糖量。3、操作步驟(1)在15ml刻度試管中加入酶液0.2ml，再各吸取1.8ml1％的木聚糖溶液；(2)空白用0.2ml酶液加1.8ml醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液，搖勻；(3)50℃水浴60min，取出后，再吸取2mldns試劑搖勻，具塞，立即沸水浴反應(yīng)10min，冷卻后，補(bǔ)加水定容到15ml，輕輕上下?lián)u勻；(4)用空白調(diào)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)550nm下測(cè)吸光度。4、計(jì)算方法按照公式計(jì)算：半纖維素酶活力＝y(tǒng)*1000ug/v酶液/t,其中y由標(biāo)曲得到y(tǒng)＝1.1504x+0.008；式中：x-測(cè)定的吸光度值；t-水浴的時(shí)間；v酶液-酶液的體積。5、結(jié)果表3bacilluslicheniformista65菌株產(chǎn)酶活性測(cè)定如表3所示，地衣芽孢桿菌a65產(chǎn)纖維素酶的活力最高，為851u/l，其次是錳過(guò)氧化物酶，其活力為264u/l，而漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶和半纖維素酶的活力分別為23u/l、44u/l和16u/l。實(shí)施例2：地衣芽孢桿菌a65(bacilluslicheniformis)的鑒定2.1實(shí)驗(yàn)主要儀器表4實(shí)驗(yàn)所用儀器2.2實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1提取dnadna使用生工《ezup柱式細(xì)菌基因組dna抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)》提取。具體操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。2.2.2pcr擴(kuò)增使用2×estaqmastermix進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)程序：2.2.3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果使用1％濃度的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120v，電泳30min，每孔上樣1ul，電泳圖譜見(jiàn)圖13。如圖13所示，pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果表明成功擴(kuò)增了細(xì)菌的16srdna片段。2.2.4測(cè)序及比對(duì)結(jié)果測(cè)序使用引物27f/1492r雙向測(cè)序，地衣芽孢桿菌菌株ta65的序列如seq.1所示。在ncbi基因庫(kù)進(jìn)行blastn比對(duì)，得菌種鑒定結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表5。表5地衣芽孢桿菌菌株ta65鑒定數(shù)據(jù)由表5所示，菌株ta65與bacilluslicheniformis相似度達(dá)到99％，因此，將菌株命名為地衣芽孢桿菌a65(bacilluslicheniformis)。實(shí)施例3：含地衣芽孢桿菌菌株ta65的菌劑在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用3.1菌劑制備把ta65種子液按1％(v/v)的接種量，接種到1l滅菌后的lb培養(yǎng)液中，在搖床(50℃，120rmp)中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液即為菌劑。添加菌劑組為實(shí)驗(yàn)組(t)，空白組(ck)添加1l滅菌后的lb培養(yǎng)液。3.2堆肥實(shí)驗(yàn)堆肥原料選用牛糞和甘蔗葉，質(zhì)量比17:3，共20kg。堆肥進(jìn)行45d，分別在第0，5，10，16，23，30，45d取樣，測(cè)定了溫度，ph，含水率，有機(jī)質(zhì)，凱氏氮，無(wú)機(jī)氮，dom含量等參數(shù)。整個(gè)堆肥過(guò)程接種菌劑兩次，分別在0d和10d。堆體翻堆三次，分別是10d，20d和30d。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果地衣芽孢桿菌ta65耐高溫，增長(zhǎng)繁殖快，且能夠產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶。與不添加菌劑的堆肥相比(ck)，添加ta65菌劑的堆肥(t)具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)堆肥過(guò)程的溫度看，添加ta65菌劑的堆體溫度比不添加菌劑的堆體溫度高。有利于滅殺堆體中病原體及加速堆肥物料的高溫降解，促進(jìn)堆體腐熟(圖1)。(2)由圖2，圖3可知，添加ta65菌劑的堆肥的ph升得更高，水分降得更快，即添加菌劑的堆體反應(yīng)更加劇烈從而導(dǎo)致nh3大量揮發(fā)增加ph，產(chǎn)熱更多帶走大量的水分。(3)從有機(jī)質(zhì)(om)的降解率看，不添加菌劑的om從90.38％下降到78.67，降解率為12.95％，添加ta65菌劑的om從90.00％下降到76.62％，降解率為14.87％(圖4)。(4)從堆體可溶性有機(jī)物(dom)含量變化的角度看，不添加菌劑的dom含量由69.6mg/g下降到9.8mg/g，下降了85.9％，添加ta65菌劑的dom含量由75.6mg/g下降到9.7mg/g，下降了87.2％(圖8)。綜上所述，添加ta65菌劑能夠提高堆肥溫度，加速有機(jī)質(zhì)降解和dom降解，提高凱氏氮的含量，促進(jìn)堆肥腐熟。實(shí)施例4：地衣芽孢桿菌菌株ta65產(chǎn)表面活性劑情況由血瓊脂平板和表面張力儀共同鑒定三株菌產(chǎn)表面活性劑情況。血瓊脂平板制法：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂(北京陸橋)，滅菌處理后，待其冷卻至50℃左右，在無(wú)菌環(huán)境于每100ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂加滅菌脫纖維綿羊血5-10ml，輕輕搖勻，立刻傾注于平板，制成斜面?zhèn)溆谩０l(fā)酵液表面張力測(cè)定：采用環(huán)法測(cè)定發(fā)酵液表面張力，采用全自動(dòng)表面張力儀，儀器型號(hào)：bzy-1。實(shí)驗(yàn)證明，地衣芽孢桿菌菌株ta65能產(chǎn)生表面活性劑。前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說(shuō)明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開(kāi)的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書(shū)及其等同形式所限定。sequencelisting<110>廣西大學(xué)<120>一種地衣芽孢桿菌菌株ta65及其在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用<130>zyws<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1450<212>dna<213>人工序列<400>1ccccgggcgctcctataatgcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcag60cggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaa120accggggctaataccggatgcttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttt180tcgctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcac240caaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacg300gcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacg360gagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaaga420acaagtaccgttcgaacagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcg540taaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggag600ggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaac720tgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggt1020ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200gtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaat1260ctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaa1320tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1380ccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgccgaagg1440tgatcagagt1450當(dāng)前第1頁(yè)12