本發(fā)明涉及il-17抗體，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：迄今為止，細胞因子的白細胞介素17(il-17)家族已有六個家族成員被發(fā)現(xiàn)：il-17a(il-17)、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e(亦命名為il-25)和il-17f。il-17是il-17家族的原型，il-17家族成員以同源二聚體或異源二聚體的形式行使功能，所有il-17家族成員具有4個高度保守的半胱氨酸殘基，其參與鏈內(nèi)二硫鍵的形成并具有兩個或更多半胱氨酸殘基，所述殘基參與鏈間二硫鍵的形成。已經(jīng)報道了il-17家族成員的許多功能，其主要參與免疫應答的調(diào)節(jié)。白細胞介素17(il-17，也被稱作il-17a)是20-30kd的同源二聚體糖蛋白，其是活化的cd4+t細胞亞群th17細胞分泌的特征性細胞因子，作為促炎細胞因子起作用。il-17具有多種生物學特性，包括上調(diào)黏著分子并從多種細胞類型包括滑膜細胞、軟骨細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞、角質(zhì)形成細胞和巨噬細胞中誘導大量炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。同樣，il-17通過誘導趨化因子的釋放誘導嗜中性粒細胞募集到炎性位點上，刺激前列腺素和金屬蛋白酶的產(chǎn)生，并抑制蛋白聚糖的合成。此外，il-17在造血祖細胞的成熟中起重要作用。已表明il-17在不同的器官和組織包括肺、關(guān)節(jié)軟骨、骨、腦、造血細胞、腎、皮膚和腸中具有信號轉(zhuǎn)導功能。il-17在體內(nèi)的產(chǎn)生增加與多種疾病相關(guān)，如呼吸道炎癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、系統(tǒng)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腹膜內(nèi)膿腫與粘連、炎性腸病、同種異體移植排斥、牛皮癬、某些類型的癌、血管發(fā)生、動脈粥樣硬化和多發(fā)性硬化。il-17逐漸被認為是某些炎性或自身免疫疾病的治療靶點，已有研究提出采用與il-17結(jié)合的抗體治療il-17介導的疾病和病癥。但已有的抗il-17在體內(nèi)的藥代動力學性質(zhì)、療效并不是很理想，并且在運輸和儲藏時需要條件苛刻均需冷藏，導致目前il-17抗體的治療應用受到局限。急需一種熱穩(wěn)定性高有利于運輸和儲藏，且親和力及其藥效動力學方面有進一步改善的抗il-17抗體，以便易于儲藏運輸?shù)耐瑫r，能實現(xiàn)低劑量低頻率給藥。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種熱穩(wěn)定性高，且同時具有高親和力、高抑制活性和高體內(nèi)活性的il-17抗體。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種il-17抗體，由重鏈和輕鏈組成，重鏈和輕鏈分別包括可變區(qū)和恒定區(qū)，重鏈可變區(qū)序列順次包含高變區(qū)hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述hcdr1為序列表seqidno:1中第25-35位氨基酸或其直接等同序列，所述hcdr2為序列表seqidno:1中第50-68位氨基酸或其直接等同序列；所述hcdr3為序列表seqidno:1中第99-124位氨基酸或其直接等同序列；輕鏈可變區(qū)序列順次包含高變區(qū)lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述lcdr1為序列表seqidno:2中第24-35位氨基酸或其直接等同序列，所述lcdr2為序列表seqidno:2中第51-57位氨基酸或其直接等同序列；所述lcdr3為序列表seqidno:2中第90-98位氨基酸或其直接等同序列,其中高變區(qū)cdr序列根據(jù)kabat定義。所述重鏈可變區(qū)序列為序列表seqidno:1的氨基酸序列或其同源序列，輕鏈可變區(qū)序列為序列表seqidno:2的氨基酸序列或其同源序列。evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfsnywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvgsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyydiltrdyydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:1)所述重鏈可變區(qū)序列提及的高變區(qū)hcdr1、hcdr2和hcdr3的直接等同序列或所述重鏈可變區(qū)序列的同源序列為序列表seqidno:1的第30位、第31位、第62位、第102位、第107位和第114位中的一個或多個氨基酸被替換的氨基酸序列。所述序列表seqidno:1的第30位s替換為y或f。所述序列表seqidno:1的第31位n替換為l或a。所述序列表seqidno:1的第62位g替換為n或q。所述序列表seqidno:1的第102位d替換為e。所述序列表seqidno:1的第107位d替換為r或k。所述序列表seqidno:1的第114位d替換為t或s。本公開所述重鏈可變區(qū)序列的同源序列，優(yōu)選以下多點替換序列：h1-1：為序列表seqidno:1的第31位n替換為l，第62位g替換為n，第102位d替換為e，即序列表seqidno:5的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfslywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrdyydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:5)h1-1-m：為序列表seqidno:1的第31位n替換為l，第102位d替換為e，即序列表seqidno:6的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfslywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvgsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrdyydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:6)h1-2：為序列表seqidno:1的第31位n替換為l，第62位g替換為n，第102位d替換為e，第107位d替換為r，即序列表seqidno:7的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfslywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrryydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:7)h1-3：為序列表seqidno:1的第31位n替換為l，第62位g替換為n，第102位d替換為e，第114位d替換為t，即序列表seqidno:8的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfslywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrdyydilttyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:8)h3-1：為序列表seqidno:1的第30位s替換為y，第62位g替換為n，第102位d替換為e，即序列表seqidno:9的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfynywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrdyydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:9)h3-1-m：為序列表seqidno:1的第30位s替換為y，第62位g替換為n，即序列表seqidno:10的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfynywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyydiltrdyydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:10)h3-2：為序列表seqidno:1的第30位s替換為y，第62位g替換為n，第102位d替換為e，第107位d替換為r，即序列表seqidno:11的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfynywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrryydiltdyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:11)h3-3：為序列表seqidno:1的第30位s替換為y，第62位g替換為n，第102位d替換為e，第114位d替換為t，即序列表seqidno:12的氨基酸序列；evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfynywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrdyydilttyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:12)h5：為序列表seqidno:1的第30位s替換為y，第62位g替換為n，第102位d替換為e，第107位d替換為r，第114位d替換為t，即序列表seqidno:13的氨基酸序列。evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfynywmnwvrqtpgkglewvaainqdgsekyyvnsvkvrftisrdnaknslylqmnslrvedtavyycardyyeiltrryydilttyyihywyfdlwgrgtlvtvssas(seqidno:13)本公開所述輕鏈可變區(qū)序列提及的高變區(qū)lcdr1、lcdr2和lcdr3的直接等同序列或所述輕鏈可變區(qū)序列的同源序列為序列表seqidno:2的第30位、第32位、第54位、第57位和第93位中的一個或多個氨基酸被替換的氨基酸序列。eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrt(seqidno:2)所述序列表seqidno:2的第30位s替換為y或f。所述序列表seqidno:2的第32位s替換為n或q。所述序列表seqidno:2的第54位s替換為h。所述序列表seqidno:2的第57位t替換為f或y。所述序列表seqidno:2的第93位g替換為n或q。所述輕鏈可變區(qū)序列的同源序列，優(yōu)選以下多點替換序列：l0：為序列表seqidno:2的氨基酸序列；l3：為序列表seqidno:2的第30位s替換為y，第54位s替換為h，即序列表seqidno:14的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvyssylawyqqkpgqaprlliygashratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrt(seqidno:14)l5：為序列表seqidno:2的第32位s替換為n，第54位s替換為h，即序列表seqidno:15的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvssnylawyqqkpgqaprlliygashratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrt(seqidno:15)l7：為序列表seqidno:2的第30位s替換為y，第57位t替換為f，即序列表seqidno:16的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvyssylawyqqkpgqaprlliygassrafgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrt(seqidno:16)l8：為序列表seqidno:2的第30位s替換為y，第93位g替換為n，即序列表seqidno:17的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvyssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqynsspltfgggtkveikrt(seqidno:17)l9：為序列表seqidno:2的第32位s替換為n，第57位t替換為f，即序列表seqidno:18的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvssnylawyqqkpgqaprlliygassrafgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspltfgggtkveikrt(seqidno:18)l10：為序列表seqidno:2的第32位s替換為n，第93位g替換為n，即序列表seqidno:19的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvssnylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqynsspltfgggtkveikrt(seqidno:19)l11：為序列表seqidno:2的第30位s替換為y，第54位s替換為h，第93位g替換為n，即序列表seqidno:20的氨基酸序列；eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvyssylawyqqkpgqaprlliygashratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqynsspltfgggtkveikrt(seqidno:20)l30-32：為序列表seqidno:2的第30位s替換為y，第32位s替換為n，第54位s替換為h，第93位g替換為n，即序列表seqidno:21的氨基酸序列。eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvysnylawyqqkpgqaprlliygashratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqynsspltfgggtkveikrt(seqidno:21)本公開中的il-17的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)優(yōu)選以下組合：重鏈可變區(qū)為h1-2，輕鏈可變區(qū)為l7(h1-2/l7)：氨基酸序列分別為序列表seqidno:7和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h5，輕鏈可變區(qū)為l3(h5/l3)：氨基酸序列分別為seqidno:13和序列表seqidno:14；重鏈可變區(qū)為h5，輕鏈可變區(qū)為l11(h5/l11)：氨基酸序列分別為seqidno:13和序列表seqidno:20；重鏈可變區(qū)為h3-3，輕鏈可變區(qū)為l7(h3-3/l7)：氨基酸序列分別為seqidno:12和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h1-3，輕鏈可變區(qū)為l11(h1-3/l11)：氨基酸序列分別為seqidno:8和序列表seqidno:20；重鏈可變區(qū)為h1-3，輕鏈可變區(qū)為l3(h1-3/l3)：氨基酸序列分別為seqidno:8和序列表seqidno:14；重鏈可變區(qū)為h1-3，輕鏈可變區(qū)為l5(h1-3/l5)：氨基酸序列分別為seqidno:8和序列表seqidno:15；重鏈可變區(qū)為h1-3，輕鏈可變區(qū)為l7(h1-3/l7)：氨基酸序列分別為seqidno:8和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h3-1，輕鏈可變區(qū)為l11(h3-1/l11)：氨基酸序列分別為seqidno:9和序列表seqidno:20；重鏈可變區(qū)為h3-1，輕鏈可變區(qū)為l3(h3-1/l3)：氨基酸序列分別為seqidno:9和序列表seqidno:14；重鏈可變區(qū)為h3-1，輕鏈可變區(qū)為l5(h3-1/l5)：氨基酸序列分別seqidno:9和序列表seqidno:15；重鏈可變區(qū)為h3-1，輕鏈可變區(qū)為l7(h3-1/l7)：氨基酸序列分別為seqidno:9和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h5，輕鏈可變區(qū)為l7(h5/l7)：氨基酸序列分別為seqidno:13和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h1-2，輕鏈可變區(qū)為l7(h1-2/l7)：氨基酸序列分別為seqidno:7和序列表seqidno:16；重鏈可變區(qū)為h1-2，輕鏈可變區(qū)為l5(h1-2/l5)：氨基酸序列分別為seqidno:7和序列表seqidno:15；重鏈可變區(qū)為h1-2，輕鏈可變區(qū)為l3(h1-2/l3)：氨基酸序列分別為seqidno:7和序列表seqidno:14；重鏈可變區(qū)為h1-2，輕鏈可變區(qū)為l11(h1-2/l11)：氨基酸序列分別為序列表seqidno:7和序列表seqidno:20。所述抗體為單鏈抗體、fab、嵌合抗體或全抗體免疫球蛋白。所述抗體還包含選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd型的重鏈恒定區(qū)和包含選自kappa或lambda亞型的輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地，所述重鏈恒定區(qū)序列為igg1亞型；所述輕鏈恒定區(qū)序列為kappa亞型。所述重鏈恒定區(qū)序列為序列表seqidno:3的氨基酸序列，輕鏈恒定區(qū)序列為序列表seqidno:4的氨基酸序列。tkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(序列表seqidno:3)vaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(序列表seqidno:4)dna序列，其編碼上述il-17抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員在已知抗體的氨基酸序列的基礎上，為了表達該抗體，能夠獲得其編碼核苷酸序列，并根據(jù)所選用的表達系統(tǒng)和使用的酶，進一步優(yōu)化采用表達系統(tǒng)偏好密碼子或增加相應的酶切位點序列。能夠在原核或真核細胞系中復制的表達載體，其包含上述dna序列。含有上述表達載體的宿主菌、宿主細胞或表達盒。轉(zhuǎn)染上述表達載體的宿主細胞，優(yōu)選為cho細胞或hek293細胞。藥物組合物，其包含上述il-17抗體與藥物學上可接受的載體。所述藥物組合物還可包括至少一種另外的治療藥物，所述治療藥物用于治療其中il-17活性是有害的疾病。所述藥物組合物可以為溶液、乳劑或混懸劑的液體劑型。發(fā)明的藥物制劑的施用可以經(jīng)胃腸外施用進行。胃腸外施用在醫(yī)學文獻中通常理解為通過無菌注射器或其它機械裝置如輸液泵將劑型注射到身體內(nèi)。胃腸外途徑可以包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥途徑。優(yōu)選皮下給藥。產(chǎn)生il-17抗體的方法，培養(yǎng)用上述表達載體轉(zhuǎn)化的生物體，并從培養(yǎng)物中回收il-17抗體。本發(fā)明的il-17抗體可以利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備，所述技術(shù)例如重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、合成技術(shù)或這些技術(shù)與本領(lǐng)域其它公知技術(shù)的組合。制備和純化抗體和抗原結(jié)合片段的方法是本領(lǐng)域熟知的。上述il-17抗體在制備用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、銀屑病、強直性脊柱炎、多發(fā)性骨髓瘤、局限性回腸炎、慢性阻塞性肺病(copd)、移植排斥中或哮喘的藥物中的用途。本公開的il-17抗體特別適用于治療、預防或改善自身免疫疾病和炎性疾病，特別是病因?qū)W包括自身免疫成分的炎性疾病，比如關(guān)節(jié)炎(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、慢性進行性關(guān)節(jié)炎和變形性關(guān)節(jié)炎)和風濕性疾病，其中風濕性疾病包括涉及骨丟失、炎性疼痛、脊椎關(guān)節(jié)病(包括強直性脊椎炎、賴特爾綜合征、反應性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和腸病性關(guān)節(jié)炎)、超敏反應(包括呼吸道超敏反應和皮膚超敏反應)和變態(tài)反應?？刹捎帽景l(fā)明抗體的特定自身免疫疾病包括自身免疫血液病(包括例如溶血性貧血、再生障礙性貧血、純紅細胞貧血和自發(fā)性血小板減少癥)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎性肌肉病(inflammatorymuscledisorders)、多軟骨炎、硬皮病、韋格納肉芽腫病、皮膚肌炎、慢性活動性肝炎、重癥肌無力、牛皮癬、史蒂芬強森綜合征、自發(fā)性口炎性腹瀉、自身免疫炎性腸病(包括例如潰瘍性結(jié)腸炎、克隆氏疾病和應激性腸綜合征)、內(nèi)分泌眼病、格雷夫斯疾病、肉樣瘤病、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬變、青少年糖尿病(i型糖尿病)、眼色素層炎(前眼色素層炎和后眼色素層炎)、干性角膜結(jié)膜炎和春季角膜結(jié)膜炎、肺間質(zhì)纖維化、銀屑病關(guān)節(jié)炎和腎小球性腎炎(具有和不具腎病綜合征，包括例如自發(fā)性腎病綜合征或微小病變性腎病)、腫瘤、多發(fā)性硬化、皮膚和角膜的炎性疾病、肌炎、骨植入物松動、代謝性疾病例如動脈硬化、糖尿病和血脂異常。本公開的il-17抗體也適用于對哮喘、支氣管炎、肺塵癥、肺氣腫和呼吸道的其他阻塞性或炎性疾病的治療、預防或改善。本公開的il-17抗體適用于治療由il-17介導的或涉及il-17產(chǎn)生或由il-17促進的tnf釋放介導的不希望的急性和超急性炎性反應，如急性感染,例如敗血癥性休克、腦膜炎、肺炎；以及嚴重燒傷；并適用于治療與病理性tnf釋放有關(guān)的、繼發(fā)于感染、癌癥或器官機能障礙的惡病質(zhì)或消瘦綜合征，尤其是例如與hiv感染有關(guān)或繼發(fā)于hiv感染的aids相關(guān)的疾病。本公開的il-17抗體尤其適用于治療包括骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和其他炎性關(guān)節(jié)炎的骨代謝疾病，以及全身骨丟失(包括與年齡有關(guān)的骨丟失)和特別是牙周疾病。本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明的il-17抗體熱穩(wěn)定性高，且具有高親和力、高抑制活性和高的體內(nèi)活性。下面結(jié)合具體實施方式對本公開做詳細的說明，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本公開內(nèi)容進行的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本公開的保護范圍。具體實施方式實施例1：抗體制備一、載體構(gòu)建先合成抗體的重鏈h3-1和輕鏈序列l(wèi)3的編碼基因，pcr擴增后，用ecori(takara，1040a)和bamhi酶(takara，1010a)分別將dna序列和pcdna3.1載體(invitrogen，v79020)進行雙酶切，分別回收酶切后的載體和目的dna片段后，使用dna連接酶試劑盒(takara/6022)16℃連接1h，分別連接重鏈和載體酶切產(chǎn)物、輕鏈和載體酶切產(chǎn)物，從而將抗體的重鏈和輕鏈分別構(gòu)建到pcdna3.1載體上形成重鏈pcdna3.1(h3-1)和輕鏈質(zhì)粒pcdna3.1(l3)。上述重鏈h3-1編碼基因包括信號肽序列(atgggatggtcatgtatcatcctttttctagtagcaactgccaccggtgtacactca,seqidno:35)、重鏈可變區(qū)序列和重鏈恒定區(qū)序列，其是在序列表seqidno:22基礎上添加信號肽序列和重鏈恒定區(qū)序列得到；輕鏈l3編碼基因包括信號肽序列、輕鏈可變區(qū)序列和輕鏈恒定區(qū)序列，其是在序列表seqidno:27基礎上添加信號肽序列和輕鏈恒定區(qū)序列得到。同樣方法，我們合成并構(gòu)建了所有突變體重鏈和輕鏈的質(zhì)粒。也可通過常規(guī)點突變的方法獲得所有突變體相關(guān)的質(zhì)粒。本公開中重鏈或輕鏈可變區(qū)部分除酶切位點和信號肽序列外的編碼基因可以是如下序列：h3-1的編碼序列：序列表seqidno:22h1-3的編碼序列：序列表seqidno:23h1-2的編碼序列：序列表seqidno:24h5的編碼序列：序列表seqidno:25h3-3的編碼序列：序列表seqidno:26h的編碼序列：序列表seqidno:31h1的編碼序列：序列表seqidno:33l3的編碼序列：序列表seqidno:27l5的編碼序列：序列表seqidno:28l7的編碼序列：序列表seqidno:29l11的編碼序列：序列表seqidno:30k的編碼序列：序列表seqidno:32l2的編碼序列：序列表seqidno:34二、抗體的表達和純化于3.5cm組織培養(yǎng)皿中接種3×105293f細胞(invitrogen，k1677，細胞培養(yǎng)至90％-95％融合時進行轉(zhuǎn)染：取36ml細胞培養(yǎng)基到125ml培養(yǎng)瓶；加360ug質(zhì)粒(重鏈質(zhì)粒：輕鏈質(zhì)粒＝1:3)，混勻；再加1080ugpei，混勻。室溫靜置15分鐘；與細胞混勻，約12.3ml/瓶；37℃，8％co2，120rpm培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第六日收集細胞上清，10000g離心20分鐘。收集上清，0.45um過濾，得到蛋白上清液。用proteina親和柱(ge)分離純化抗體，使用0.1m甘氨酸溶液(ph3.2)洗脫得到目的抗體，離心濃縮至濃度約為1mg/ml。使用20mmpbs，150mmnacl，ph7.2的緩沖溶液儲存。得到純化后的抗體h1-2/l7、h5/l3、h5/l11、h3-3/l7、h1-3/l11、h1-3/l3、h1-3/l5、h1-3/l7、h3-1/l11、h3-1/l3、h3-1/l5、h3-1/l7、h5/l7、h1-2/l7、h1-2/l5、h1-2/l3、h1-2/l11等。實施例2il-17抗體與抗原間的結(jié)合親和力kd檢測一、儀器和原理本實驗通過生物膜層干涉技術(shù)(bli)檢測評價il-17抗體與抗原間的親和力強弱，從而確定所選抗體在動力學和親和力上的優(yōu)越性。實驗使用octet儀器(fortebio公司，型號為qke)進行測定。使用thermofisher公司的生物素化試劑盒(ez-linktmsulfo-nhs-biotincat:21326)進行生物素標記。二、實驗方法實驗主要包括以下步驟(未做特殊說明的情況下實驗在室溫下進行)：打開機器octet的電源，預熱機器1小時以上。將未使用的sasensor放置于取用架上，取用架下方對應孔中加入300uldpbs緩沖液(0.05％bsa，0.1％tween)，使sensor在緩沖液中孵育10min以上，以溶解sensor前端包裹的蔗糖。使用pbs緩沖液(0.05％bsa，0.1％tween)稀釋生物素化人源il-17a抗原(hil-17a，金斯瑞，z03228-50)至0.33ug/ml，加入至黑色不透光96孔板中，300ul/孔。使用pbs緩沖液(0.05％bsa，0.1％tween)稀釋上述實施例2制備的各抗體樣品至5ug/ml，加入96孔板的相應孔中，300ul/孔，共3復孔。使用pbs緩沖液(0.05％bsa，0.1％tween)設置一組空白對照。使用dataacquisition8.2設置運行程序，使sasensor結(jié)合生物素化抗原(180sec)后，與一組候選抗體反應(300sec)測定結(jié)合反應中kon數(shù)據(jù)，然后置于pbs緩沖液(0.05％bsa，0.1％tween)中(1800sec)測定解離反應中koff數(shù)據(jù)。使用10mm甘氨酸清洗sasensor后同樣的方法測定下一組候選抗體。運行結(jié)束后使用dataanalysis8.2分析軟件分析所得數(shù)據(jù)文件，根據(jù)所得kd數(shù)據(jù)對候選抗體進行排序。三、實驗結(jié)果1.重鏈(h鏈)單點替換的測定平均結(jié)果如表1所示：表1sampleidconc.(nm)kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2s30y33.39.49e-115.28e+055.01e-050.9555n31l33.31.12e-104.99e+055.57e-050.938g62n33.35.75e-116.34e+053.64e-050.9117d102e33.3<1.0e-124.29e+051.75e-070.9484d107r33.31.27e-104.83e+056.12e-050.9768d114t33.31.32e-105.10e+056.71e-050.95822.輕鏈(l鏈)單點替換的測定平均結(jié)果如表2所示：表2sampleidconc.(nm)kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2s30y33.34.65e-115.97e+052.78e-050.9335s32n33.3<1.0e-123.22e+05<1.0e-070.9824s54h33.31.10e-113.65e+054.00e-060.9846t57f33.33.33e-114.68e+051.56e-050.9247g93n33.32.14e-104.49e+059.58e-050.98053.重鏈(h鏈)多點替換的測定平均結(jié)果如表3所示：表3sampleidconc.(nm)kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2h1-133.32.76e-114.76e+051.32e-050.9677h3-133.35.96e-116.33e+053.77e-050.9197h1-1-m33.37.28e-115.23e+053.81e-050.9508h1-333.38.47e-123.92e+053.32e-060.9642h3-1-m33.32.58e-115.16e+051.33e-050.945h3-233.33.68e-116.86e+052.53e-050.9091h1-233.39.64e-123.42e+053.30e-060.9935h3-333.31.21e-105.83e+057.05e-050.9659h533.31.81e-105.11e+059.24e-050.97894.輕鏈(l鏈)多點替換的測定結(jié)果如表4所示：表4sampleidconc.(nm)kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullr^2l333.37.72e-114.78e+053.69e-050.9682l833.33.06e-104.59e+051.40e-040.9711l933.31.52e-104.92e+057.47e-050.9765l733.32.95e-114.64e+051.37e-050.9677l533.35.90e-115.18e+053.05e-050.9635l1033.31.55e-106.48e+051.00e-040.951l1133.31.10e-105.00e+055.48e-050.9672l30-3233.31.44e-106.31e+059.07e-050.9395.重鏈(h鏈)與輕鏈(l鏈)同時多點替換的測定平均結(jié)果如表5所示，其中h/k(參見專利cn101001645b)、h1/l2(參見專利cn103154026b)為對照組：表5由上述表中重鏈(h鏈)與輕鏈(l鏈)同時多點替換的測定平均結(jié)果可知，與已有抗體相比，本發(fā)明的抗體親和力都較高，部分抗體親和力kd<1.0e-12。實施例3hil-17抗體抑制活性測定一、原理和材料將hil-17抗體作用于hil-17a刺激的人胚胎皮膚成纖維細胞(簡稱ccc-esf-1細胞，協(xié)和細胞資源中心)，通過定量hil-17a刺激的ccc-esf-1細胞釋放的il-6水平，說明hil-17抗體的抑制活性,其中il-6用humanil-6elisa檢測試劑盒(r&dsystem，d6050)進行定量。二、實驗方法ccc-esf-1細胞以1×104個/孔的密度接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃，5％co2過夜培養(yǎng)。然后分為空白對照、對照組、實驗組對細胞進行處理。(1)空白對照組加入dmem細胞培養(yǎng)基(gibco，11995-065)進行稀釋；(2)對照組加入30ng/ml(1.67pmol/ml)的hil-17a(genscript，z03228-50)；(3)實驗組：在加入的hil-17抗原劑量一定(終濃度為1.67pmol/ml)時，按照摩爾比為0.25:1，0.5:1，1:1，2:1，4:1，8:1，16:1，32:1分別進行抗原與抗體等體積混合后處理細胞。37℃孵育1h后加入到96孔板細胞中(每組分別設置3個復孔)，37℃，5％co2細胞培養(yǎng)箱孵育24h后，各孔均取100μl上清液然后按照elisa試劑盒的操作說明對il-6進行檢測。通過使用graphpadprism5軟件對抑制曲線進行擬合確定各抗體的ic50各抗體ic50結(jié)果如下表6所示：表6抗體編號ic50(pm)h/k431h1/l2654h1-2/l7210h5/l3242h3-3/l7192h5/l0155h3-1/l0188h3-2/l0172h3-1/l3275h3-1/l5288h3-1/l11323h1-3/l5375h3-1/l7274h1-3/l3382h1-3/l7199h1-2/l5183實施例4、動物體內(nèi)測活方法一、原理和材料本發(fā)明的hil-17抗體能夠在cd-1小鼠體內(nèi)阻斷hil-17的活性。hil-17能夠結(jié)合并刺激小鼠il-17受體，導致趨化因子cxcl1(kc)的大量釋放。篩選了hil-17體內(nèi)誘導小鼠kc產(chǎn)生的最佳劑量和時間，通過給予hil-17抗體抑制kc產(chǎn)生的程度來評價hil-17抗體的效果。訂購spf級別cd-1小鼠，小鼠規(guī)格為雄性，體重30-35g。隨機分為三組：正常對照組、hil-17模型組及各實驗組(各待測hil-17抗體組)，每組5只。二、實驗方法正常對照組和hil-17模型組給藥dpbs緩沖液(thermofisher，14190-144)。實驗組：根據(jù)預實驗的結(jié)果選定hil-17和hil-17結(jié)合劑的最佳劑量，每只小鼠尾靜脈注射各待測hil-17抗體，劑量為12μg/只，體積為0.3ml，濃度為40μg/ml。給藥0.5h后，除正常對照組外所有小鼠均背部皮下注射hil-17(金斯瑞，z03228-50)，劑量為3μg/只，體積為0.2ml，濃度為15μg/ml，其中正常對照組給藥dpbs緩沖液。在hil-17作用2h后，眼眶取血收集血清，將小鼠安樂死。使用elisa法測定血清中的kc含量，進行藥效評估。三、實驗結(jié)果測定結(jié)果如下表7所示。表7由上表可知，與已有抗體相比，本發(fā)明的抗體在體內(nèi)抑制kc產(chǎn)生的能力更強，療效更好。實施例5il-17抗體的熱穩(wěn)定性檢測一、檢測原理因芳香族氨基酸在紫外照射下產(chǎn)生熒光，而蛋白在加熱過程中由于本身結(jié)構(gòu)的去折疊，內(nèi)部的芳香族氨基酸暴露在水環(huán)境中，會引起熒光的淬滅。故使用熒光光譜觀察蛋白熒光淬滅過程可得到能夠反應蛋白去折疊(變性)的數(shù)據(jù)—tm值。同時，利用sls(靜態(tài)光散射)對溶液中溶質(zhì)粒子粒徑變化的監(jiān)測，得到該蛋白開始聚集的溫度—tagg值。高的tm值和tagg值可說明蛋白樣品能夠在更高的溫度下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。本實驗采用儀器unit(unchainedlabs)測定。二、實驗方法啟動機器unit(unchainedlabs)，稀釋抗體樣品至統(tǒng)一濃度250ug/ml，10000rpm1分鐘離心。取8.5ul加入到檢測管中在unit.client中設置運行程序：設置檢測起點20℃，終點95℃，每分鐘上升0.3℃，孵育0分鐘。運行程序，然后在unit.analysis中分析所存結(jié)果、保存分析結(jié)果。samplename變性起始溫度(℃)聚集起始溫度(℃)h/k61.566.7h1/l262.766.3h1-2/l568.574.3h1-2/l767.975.7h1-2/l1168.874.2h3-3/l768.275.4上述熱穩(wěn)定性實驗結(jié)果說明，與已有抗體相比，本發(fā)明的抗體熱穩(wěn)定性更好，更有利于儲存和運輸。序列表<110>舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司<120>il-17抗體<130><160>35<170>patentinversion3.5<210>1<211>137<212>prt<213>人工序列<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserasntyr202530trpmetasntrpvalargglnthrproglylysglyleuglutrpval354045alaalaileasnglnaspglyserglulystyrtyrvalglyserval505560lysvalargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasptyrtyraspileleuthrargasptyrtyraspileleu100105110thrasptyrtyrilehistyrtrptyrpheaspleutrpglyarggly115120125thrleuvalthrvalserseralaser130135<210>2<211>110<212>prt<213>人工序列<400>2gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserpro859095leuthrpheglyglyglythrlysvalgluilelysargthr100105110<210>3<211>328<212>prt<213>人工序列<400>3thrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthr151015serglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrphepro202530gluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyval354045histhrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuser505560servalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrile65707580cysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargval859095gluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproala100105110progluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolyspro115120125lysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalval130135140valaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrval145150155160aspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglugln165170175tyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgln180185190asptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysala195200205leuproalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnpro210215220arggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthr225230235240lysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproser245250255aspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyr260265270lysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyr275280285serlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphe290295300sercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlys305310315320serleuserleuserproglylys325<210>4<211>105<212>prt<213>人工序列<400>4valalaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleu151015lysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrpro202530argglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnsergly354045asnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyr505560serleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshis65707580lysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserproval859095thrlysserpheasnargglyglucys100105<210>5<211>137<212>prt<213>人工序列<400>5gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserleutyr202530trpmetasntrpvalargglnthrproglylysglyleuglutrpval354045alaalaileasnglnaspglyserglulystyrtyrvalasnserval505560lysvalargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasptyrtyrgluileleuthrargasptyrtyraspileleu100105110thrasptyrtyrilehistyrtrptyrpheaspleutrpglyarggly115120125thrleuvalthrvalserseralaser130135<210>6<211>137<212>prt<213>人工序列<400>6gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserleutyr202530trpmetasntrpvalargglnthrproglylysglyleuglutrpval354045alaalaileasnglnaspglyserglulystyrtyrvalglyserval505560lysvalargphethrileserargaspasnalalysasnserleutyr65707580leuglnmetasnserleuargvalgluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargasptyrtyrgluileleuthrargasptyrtyraspileleu100105110thrasptyrtyrilehistyrtrptyrpheaspleutrpglyarggly115120125thrleuvalthrvalserseralaser130135<210>7<211>137<212>prt<213>人工序列<400>7gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserleutyr202530trpmetasntrpvalargglnthrproglylysglyleuglutrpval354045alaalaileasnglnaspglyserglulystyrtyrvalasnserval505560lysvalargphethrileserargas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