本發明涉及免疫檢測
技術領域：
，具體地，涉及一種基于發光量子點納米微乳探針檢測樣品中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量的試劑盒。
背景技術：
：細胞角質蛋白19片段（cyfra21-1）分子量約為30kda。生理狀況下，細胞角質蛋白19廣泛表達在多種組織細胞表面，常見于鱗狀上皮和層狀上皮細胞。在上皮細胞惡性癌變的進程中，激活的蛋白酶系統加速了細胞的降解，大量的細胞角質蛋白片段隨之釋放進入血液循環系統。由于該可溶性片段可與兩株單克隆抗體ks19.1和bm19.21特異性結合，故稱為cyfra21-1。cyfra21-1目前被認為是一種主要用于檢測肺癌的腫瘤標記物。癌胚抗原(cea)是一種糖蛋白復合物，分子量約為220kda左右，它是由加拿大科學家samuelo.freedman和philgold于1965年在結腸癌組織提取物當中首次發現。通常而言，癌胚抗原是在胎兒時期，由胃腸道組織、胰和肝臟細胞合成，并在出生后基本停止合成。因此正常健康個體的血清當中癌胚抗原的含量維持在很低的水平，約為2.5μg/ml。通常認為，血清中cea水平的升高在胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺髓樣癌患者當中較為常見，也常見于一些非腫瘤性疾病當中，比如潰瘍性結腸炎、胰腺炎、肝硬化、慢性阻塞性肺病、克羅恩病等。因此，血清當中cea含量的檢測對上述疾病的診斷與治療具有重要的價值。肺癌是常見的惡性腫瘤，是難治的實體瘤之一，死亡率在各類惡性腫瘤中居首位，發病率呈逐年上升趨勢。其5年生存率僅為13%，而當中將近60%的患者由于發現得較晚，已經不能進行手術治療，大部分腺癌對化療、放療不敏感。提高肺癌患者生存的主要手段是早期診斷，早期治療。血清腫瘤標志物的異常往往早于影像學的異常,對于無臨床相關癥狀患者，任何一項標志物的異常都可能具有提示意義。因此，多個腫瘤標志物的同步聯合檢測具有非常重要的臨床意義。目前常規的腫瘤標志物的免疫學檢測大多采用酶免疫分析、化學發光免疫分析和時間分辨熒光免疫分析（trfia）等。酶聯免疫法試劑盒為定性或半定量試劑，不能為臨床醫生提供精確的定量，很難有效指導臨床的治療。化學發光免疫分析與其它標記技術相比有許多優點：①無放射性輻射的危害；②靈敏度高，檢測線性范圍寬；③穩定性好、自動化程度高；④應用范圍寬，可檢測不同分子大小的抗原、半抗原和抗體，又可以用于核酸探針的檢測。缺點是發光過程短、樣品不能重復檢測、本底較高及易受環境物質干擾。目前國內使用大部分為roche、abbott、beckman為代表的進口試劑。trfia技術是繼放射免疫分析之后標記物發展的一個新里程碑，已成為生物醫學研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發展前景的分析手段。trfia以稀土離子作為標記物，具有制備簡便、儲存時間長、無放射性污染、標準曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾和應用范圍十分廣泛等優點。然而，目前國內外廠家均采用基于微孔板trfia技術，由于微孔板的固液相反應面積小，需要的免疫反應時間較久；微孔板包被抗體或抗原是通過物理吸附包被，包被抗體或抗原很難標準化，使得檢測結果精密度較差；微孔板trfia技術主要為半自動檢測，或前處理加上trfia檢測儀的準全自動檢測，使得樣本需要積累到一定量后才能檢測。免疫側向流（lfia）是一種將免疫檢測與層析分析技術等多種方法有機結合在一起的固相標記免疫檢測技術。其原理在于，以纖維素硝酸酯薄膜為固相載體，樣品在毛細作用下在測試條上泳動，樣品中的待測分子與膜上的特異性抗體結合，最終形成抗體-抗原-抗體的三文治樣免疫復合物。通過一定的檢測手段，可以測得膜上的信號，從而對樣品中待測物進行定性或定量分析。該檢測方法與傳統免疫學檢測方法相比，有著明顯的優勢：1.檢測快速。通常而言，lfia檢測只需15到30分鐘，即可完成整個檢測過程，因為lfia把樣品的預處理、加樣、免疫反應等步驟整合在一起。2.檢測方便。一般lfia檢測信號的儀器都較為輕便，方便家庭或災害現場使用。3.無需特殊技術培訓。對于lfia，操作人員只需完成一個步驟即可：加樣-檢測。因此特別適合家庭或社區用于疾病的檢查。傳統的免疫側向流，是使用膠體金作標記物，并對結果用肉眼進行判斷，通常只能作定性或半定量檢測，而且通常一次只能檢測一項抗原分子。隨著技術的進步，近年來也有使用熒光物質作標記物的lfia。而一般的熒光物質，有著熒光信號較弱，容易被光漂白，不易于保存等弱點。技術實現要素：本發明的目的是為了克服現有技術的上述不足，提供一種基于發光量子點納米微乳探針檢測樣品中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量的試劑盒。為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：一種檢測樣品中cyfra21-1與cea含量的試劑盒，包括免疫層析檢測試紙條和功能性量子點納米微乳探針；所述功能性量子點納米微乳探針的制備方法如下：將發射波長在520～620nm之間的油溶性量子點鑲嵌或包裹入羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基修飾的聚苯乙烯納米微球，制備得到量子點納米微乳，將量子點納米微乳分別與cyfra21-1檢測單抗、cea檢測單抗、質控檢測抗體共價連接，并對其表面修飾葡聚糖凝膠，分別得到抗cyfra21-1量子點探針、抗cea量子點探針、質控量子點探針；所述免疫層析檢測試紙條的檢測線上分別包被cyfra21-1包被單抗、cea包被單抗，質控線上包被質控包被抗體。本發明使用量子點納米微乳作標記物，與普通熒光物質相比，它有著激發波譜寬，發射譜窄而對稱，光穩定性好，熒光信號強等優點。另外，雖然目前量子點在免疫分析、細胞成像等領域已有廣泛的應用，但量子點與聚苯乙烯納米材料相結合并用于lfia檢測腫瘤相關抗原尚無文獻報道。一般而言，基于生物相容性的考慮，在生物學、醫學領域使用的量子點是水溶性量子點。然而，由于量子點自身的膠體特性，轉相的量子點十分不穩定，容易發生聚集、沉淀，而熒光強度也較低。而本發明使用的發光量子點納米微乳探針則能很好的解決上述難題。通過把油溶性量子點包埋在聚苯乙烯納米乳膠內部，可以有效避免外部水相環境帶來的影響，保證其優異的光學性能。油溶性量子點的材料可以是硒化鎘，硫化鎘或碲化鎘為核的各種半導體納米晶體，根據具體情況選擇所需波長的量子點，只要其發射波長在520～620nm之間，均適合本發明。量子點的生物應用層出不窮，因其抗光漂白性極強，亮度高，一束激光光源可同時激發不同顏色的量子點，而且能經受激光的多次激發照射而熒光強度無明顯變化；此外，量子點的光譜stock位移比較寬，熒光發射峰窄而對稱，無拖尾，該特性使得發光量子點納米微乳探針能滿足該免疫分析方法靈敏度和精密度要求，不需要昂貴的紅敏檢測器件。本發明使用的乳膠球是羧基、氨基、羥基、醛基或磺酸基等生活活性化合物修飾的聚苯乙烯納米微球，這些微球具備以下特性：表面具有多孔性、表面含有羧基化合物、光學通透性、粒徑分布均勻。優選地，所述乳膠球為聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性膠乳納米微球。所述量子點納米微乳的具體制備方法為：取溶解于正己烷濃度為1～5μm的量子點加入甲醇中，震蕩后離心、去除上清液；然后加入三氯甲烷溶解沉淀得量子點溶液，其中溶解于正己烷濃度為1～5μm的量子點：甲醇：三氯甲烷的體積比為2:20:1～2；取膠乳納米微球加入到相當于微球8～9倍體積的正丁醇中，制得納米微球懸液；將納米微球懸液與量子點溶液按照10:1～4.5:1的體積比混合，室溫孵育，離心、洗滌數次后得到發光量子點納米乳膠微球。本發明制得的量子點納米乳膠微球作為檢測腫瘤標志物抗原傳感器的重要組成部分，其表面含有大量的羥基、羧基和氨基官能團，能單分散于生物用緩沖液中，克服了自身因為羧基的負電荷密度高所導致的沉淀問題，也解決了對生物分子的非特異性吸附問題。發光量子點納米乳膠微球與抗體的連接方法為：(1)量子點納米乳膠微球用mes溶液離心、洗滌2～3次，洗滌后的量子點納米乳膠微球用mes溶液配置成2～3mg/ml的量子點納米乳膠微球溶液；(2)往上述量子點納米乳膠微球溶液中分別加入溶于mes溶液、濃度為10～15mg/ml的sulfo-nhs溶液和溶于mes溶液、濃度為10～15mg/ml的edac溶液，室溫震蕩孵育得混合液a，點納米乳膠微球溶液、sulfo-nhs溶液、edac溶液的體積比為40:9:1；(3)將準備用于偶聯的抗體溶于mes溶液中得到濃度為1～2mg/ml抗體溶液；(4)向混合液a中加入步驟(3)制得的抗體溶液，室溫下震蕩孵育即得，混合液a與抗體溶液的體積比為4～6:1。優選地，步驟（1）、（2、（3）中所述mes溶液均為50mm，ph5.0的mes溶液。優選地，步驟（1）中配置成2.5mg/ml的量子點納米乳膠微球溶液。優選地，步驟（1）中sulfo-nhs溶液和edac溶液的濃度均為10mg/ml。優選地，抗體溶液的濃度為1mg/ml，混合液a與抗體溶液的體積比為5:1。更優選地，發光量子點納米乳膠微球與抗體的連接方法為：(1)量子點納米乳膠微球用mes溶液離心、洗滌2～3次，洗滌后的量子點納米乳膠微球用mes溶液配置成2.5mg/ml的量子點納米乳膠微球溶液；(2)往上述量子點納米乳膠微球溶液中分別加入溶于mes溶液、濃度為10mg/ml的sulfo-nhs溶液和溶于mes溶液、濃度為10mg/ml的edac溶液，室溫震蕩孵育得混合液a，點納米乳膠微球溶液、sulfo-nhs溶液、edac溶液的體積比為40:9:1；(3)將準備用于偶聯的抗體溶于mes溶液中得到濃度為1mg/ml抗體溶液；(4)向混合液a中加入步驟(3)制得的抗體溶液，室溫下震蕩孵育即得，混合液a與抗體溶液的體積比為5:1。之后需要對量子點納米乳膠微球探針進行表面非特異性處理。具體的表面非特異性處理方法如下：使用磷酸緩沖液配置濃度為5%的牛血清白蛋白（質量/體積），將量子點納米乳膠微球探針加入到牛血清白蛋白溶液中，孵育48小時，離心洗滌后即可得到功能性發光量子點納米微乳探針。因為牛血清白蛋白含有較多的憎水基團，往往用于生物學領域的各種器皿或生物分子的非特異性吸附處理，該方法簡便，易于大批量處理。本發明中免疫層析試紙條中檢測線或質控線上的抗體的包被步驟為：用包被液（50mmtris-hcl，ph7.0）稀釋包被抗體，抗體終濃度為2mg/ml；用biodot畫膜儀進行畫線，速度為0.8μl/cm，畫線距離膜條末端2.5cm，隨后把膜條置于37℃烘干過夜。本發明中樣品墊處理液的制備方法為：準確稱取na2b4o7·10h2o38.18g,nan30.2g,casein-na2g溶解于800ml去離子水中，完全溶解后加入60mltritonx-100，并定容至1l。玻璃纖維墊用所得樣品墊處理液完全浸潤兩小時。用吸水紙吸干后將該樣品墊放置于37℃烘干過夜。本發明使用的分析緩沖液配方為：tris-hcl(50mmol/l)、peg6000(1.5%)、bsa(0.2%)、proclin300(0.1%)、牛igg(0.02%)、tween20(0.1%)和nacl(0.84%)ph7.8緩沖液。本發明的發光量子點納米微乳探針懸浮保存液配制方法為：準確稱取tris0.242g,bsa1g,nan30.02g,蔗糖20g,海藻糖5g，加入80ml去離子水，待完全溶解后調整ph為9.0并定容至100ml。本發明的校準品制備步驟為：用含2g/lbsa及1g/lnan3的50mmol/lph7.8tris-hcl緩沖液，分別將cyfra21-1抗原與cea抗原配制成0、1.3、3.6、18、95、480ng/ml和0、2.8、8、40、145、640ng/ml系列濃度的校準溶液，按每瓶1ml分裝凍干，4℃保存備用。本發明的測定方法為：取抗cyfra21-1量子點探針（2mg/ml）7.5μl、抗cea量子點探針（2mg/ml）10μl、質控量子點探針（0.5mg/ml）1.5μl與761μl的分析緩沖液相混合震勻，得到量子點探針工作液；取10μl樣品或校準品與60μl量子點探針工作液相混合后滴加在試紙條樣品墊上。靜置15min后在讀膜儀上讀取熒光值。在本發明的研究過程中，發明人首先對所用的原材料進行篩選試驗和質量檢定，包括功能性發光量子點納米微乳探針的制備、標記物和抗體的比例、標記物的稀釋度等通過反復探索和試驗比對最終找到了簡便、效率高、成本低、質量可靠的連接和標記方法。本發明公開了基于上述探索試驗得到的各種試劑配方，包括：樣品墊處理液、分析緩沖液、量子點納米微乳探針懸浮保存液配方。本發明的檢測試劑盒的基礎是雙抗體夾心的免疫反應：以纖維素硝酸酯薄膜為固相載體并包被上特異的單克隆抗體；樣品與發光量子點納米微乳探針標記的單克隆抗體混合后滴在試紙條上；混合液在毛細作用下在測試條上泳動，樣品中的待測分子與膜上的特異性抗體結合，最終形成抗體-抗原-抗體的三文治樣免疫復合物。用讀條儀分別讀取檢測線1、檢測線2和質控線的熒光值，并分別計算檢測線與質控線之間的熒光比值（r值）。該r值與樣品中對應的待測物的濃度成正比，對照標準曲線即可確定樣品中抗原含量。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明提供的試劑盒對cyfra21-1和cea具有較高的檢測靈敏度、特異性及穩定性，且反應時間短，操作簡便，可提高臨床檢驗速度，可實現樣本的即時檢測。附圖說明圖1為制備所得量子點納米微乳探針的場發射掃描電鏡照片與熒光譜圖。圖2為本發明檢測的流程示意圖。圖3為基于發光量子點納米微乳探針的新型快速診斷檢測細胞角質蛋白19片段與癌胚抗原的檢測方法的校準品擬合標準曲線。圖4為本方法與roche公司的電化學發光試劑盒檢測臨床血樣結果的相關性分析（回歸分析）。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發明，并非用于限定本發明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例中所使用的聚苯乙烯-二乙烯基苯羧酸改性膠乳購自thermofisherscientific公司（貨號8300-0520100390），脂溶性量子點（貨號q21701mp）購自invitrogen公司，偶聯劑edac、sulfo-nhs等化學試劑均購自美國sigma-aldrich公司，所用到的癌胚抗原單克隆抗體（s001及6f11）、cyfra21-1單克隆抗體（標記抗體及包被抗體）、山羊抗兔igg、兔igg、癌胚抗原重組抗原、cyfra21-1重組抗原均購自中山大學達安基因公司，其他化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。實施例1一種基于發光量子點納米微乳探針檢測樣品中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量的試劑盒，包括免疫層析試紙條和功能性發光量子點納米微乳探針。其中，功能性發光量子點納米微乳探針包括三種，一種是偶聯癌胚抗原單克隆抗體s001的功能性發光量子點納米微乳探針，一種是偶聯角質蛋白19片段單克隆抗體的功能性發光量子點納米微乳探針、一種是偶聯兔igg的功能性發光量子點納米微乳探針。一、功能性量子點納米微乳探針的制備，方法如下：1、乳膠球的預處理：將100μl納米乳膠球（粒徑205±3nm，質量濃度為100mg/ml，固體濃度為10%）于14000rmp，4℃離心；棄去上清液，并重懸于400μl正丁醇溶液中，超聲重懸，得乳膠球溶液。2、量子點的預處理：取100μl油溶性量子點（發射波長為605nm，濃度為3mg/ml），加入到1ml甲醇中，劇烈震蕩1分鐘后，14000rpm離心3分鐘，去除上清液，沉淀用100μl三氯甲烷溶解，得量子點溶液。3、將步驟2的量子點溶液與步驟1的乳膠球溶液相混合，室溫震蕩孵育1.5h后，14000rpm，4℃離心，洗滌數次，最終用10ml的tbst溶液保存，得量子點納米乳膠微球，其濃度為1mg/ml。4、量子點納米乳膠微球與抗體的偶聯：(1)取3ml上述制得的量子點納米乳膠微球，加入到10ml的mes溶液中（50mm，ph5.0），14000rpm離心10分鐘，去除上清液，往沉淀中加入10ml的mes溶液（50mm，ph5.0），超聲重懸。重復上述步驟3次后，所得量子點納米乳膠微球平均分為三份，每份1mg，每份微球重懸于400μl的的mes溶液（50mm，ph5.0）中；(2)分別稱取0.3mg的edac與3mg的sulfo-nhs，分別溶解于300μl和30μl的mes溶液（50mm，ph5.0）中，使其濃度均為10mg/ml。往上述每份量子點納米乳膠微球中分別加入90μl的sulfo-nhs溶液與10μl的edac溶液，室溫震蕩孵育30分鐘；(3)將準備用于偶聯的抗體分別加入到截留量為100kda的amicon?ultracentrifugalfilters截留管中，按說明書方法洗去抗體保存液中的疊氮鈉等會影響到偶聯效果的物質，同時對抗體進行了濃縮。最終濃縮抗體保存在mes溶液（50mm，ph7.4）中，濃度均為1mg/ml。(4)將步驟(2)中孵育完畢的量子點納米乳膠微球離心、洗滌數次，以除去殘留的未反應的分子，洗滌過程使用的緩沖液為mes溶液（50mm，ph7.4）。洗滌完畢的量子點納米乳膠微球最終加入400μl的mes溶液（50mm，ph7.4），超聲重懸分散。(5)分別往每份量子點納米乳膠微球懸液中加入100μl步驟(3)制得的抗體溶液，混合液在室溫下震蕩孵育兩小時。5、量子點納米乳膠微球探針進行表面非特異處理，最終得到功能性發光量子點納米微乳探針，步驟如下：(1)將上述與抗體偶聯后的量子點納米乳膠微球探針離心、洗滌數次，洗滌用溶液為pbs溶液。(2)每份量子點納米乳膠微球探針分別加入1ml含bsa的tbst溶液（50mmol/l，bsa5%，ph7.0），超聲重懸分散后，室溫震蕩孵育30分鐘。(3)量子點納米乳膠微球探針進行離心、洗滌數次，洗滌緩沖液為50mm的tbst緩沖液，以洗去多余的未參與反應的蛋白分子。最終得到的功能性發光量子點納米微乳探針，分別加入500μl懸浮保存液，超聲重懸分散，其濃度為2mg/ml，4℃保存待用。二、免疫層析試紙條的結構如圖1所示，免疫層析試紙條的制備方法如下。預先對玻璃纖維薄膜作處理，同時在硝酸纖維素薄膜上包被檢測抗體（檢測線1、2上分別包被角質蛋白19片段單克隆抗體、癌胚抗原單克隆抗體，質控線上包被山羊抗兔igg），隨后將玻璃纖維膜、硝酸纖維素薄膜、吸水紙組裝并裁切得到試紙條。需要說明的是，與發光量子點納米乳膠球偶聯的癌胚抗原單克隆抗體，與包被在檢測線上的癌胚抗原單克隆抗體是針對不同抗原決定簇的單抗，檢測的原理是雙抗夾心法，角質蛋白19片段單克隆抗體也是同理設計的。實施例2一種基于發光量子點納米微乳探針檢測樣品中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量的試劑盒，包括免疫層析試紙條和功能性量子點納米微乳探針。一、功能性量子點納米微乳探針的制備，方法同實施例1。二、免疫層析試紙條的結構如圖1所示，免疫層析試紙條的制備方法如下：1、樣品墊的預處理：將玻璃纖維膜裁切成1.2cm×30cm的條狀，之后把條狀玻璃纖維膜浸潤在樣品墊處理液中，室溫下浸泡兩小時。用吸水紙吸干其液體后，置于37℃烘干過夜，烘干的樣品墊保存在干燥陰冷的場所待用。2、硝酸纖維素薄膜的處理：將硝酸纖維素薄膜裁切成2cm×30cm的條狀。將欲包被在膜上的抗體預先用包被液稀釋，使其終濃度為2mg/ml。用biodot劃線儀器，將抗體均勻地畫在硝酸纖維素薄膜上，37℃烘干過夜，烘干的硝酸纖維素薄膜保存在干燥陰涼的場所待用。3、檢測試紙條的組裝：將吸水紙、支持板、硝酸纖維素薄膜、樣品墊按圖2的方式組裝并裁切成3mm×6cm，并與檢測卡外殼相組裝，制備好的試紙條保存在干燥陰涼的場所待用。應用例1本發明基于發光量子點納米微乳探針檢測樣品中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量的試劑盒本發明的使用方法如下：1、樣本采集：取10微升全血樣品或血清，可為指尖、耳垂或靜脈采血。2、試劑準備：分別取抗cyfra21-1、抗cea、山羊抗兔的量子點納米微乳探針和分析緩沖液，按7.5:10:1.5:761的比例混合即配制成工作液。3、上樣操作：取上述工作液60μl與檢測樣本相混合，加到上樣孔中。4、信號讀取與結果研判：將檢測試紙條水平靜置15分鐘后用儀器讀取其熒光值，并由儀器內置軟件計算同時得到樣本中角質蛋白19片段與癌胚抗原含量。實施例3本發明的方法學檢定按照本領域中常規的制造和檢定規程對該分析方法進行檢定，結果如下：1、分析靈敏度與線性范圍：以零參考標準品當作樣品測量8次，計算其r平均值及標準差。以該點r平均值加2倍標準差所得的熒光值代入標準曲線方程計算得出的濃度值為其靈敏度，經測定本試劑對cyfra21-1分析靈敏度為0.16ng/ml，對cea分析靈敏度為0.35ng/ml。將抗原稀釋成不同濃度進行測定，測得標準曲線線性范圍分別為cyfra21-1：1.3~500ng/ml；cea：1.2～1000ng/ml。2、精密度：用本發明對自制的質控品進行測定，各設10個復孔，結果如表1所示。表1本方法精密度檢定結果3、特異度：將高濃度的afp、ca125、ca19-9及人白蛋白當作樣品用本試劑盒測定，結果表明無明顯交叉反應，見表2。表2特異性檢定結果檢測項目afpca125ca19-9白蛋白樣品濃度1000iu/ml600u/ml500u/ml1000ng/ml測定濃度(ng/ml)0.090.10.070.135實施例4本發明的試劑盒與國內外相關試劑盒臨床血樣測值比較。用本發明的試劑盒和羅氏公司的電化學發光試劑盒同時對120例cyfra21-1和70例cea血樣進行檢測。對本方法所得結果與國外公司試劑盒所得結果作回歸分析。結果如圖4所示，其中cyfra21-1的回歸方程為：y=0.9282×x+2.051(r2=0.9862)，cea的回歸方程為：y=1.650×x+13.41(r2=0.9509)。統計學結果表明，本發明檢測方法與羅氏公司的電化學發光試劑盒臨床血樣測值具有顯著相關性。當前第1頁12