【技術領域】

本發明涉及檢測技術領域，特別涉及一種用于特異性檢測水相中ph值的熒光探針及其制備方法及該熒光探針在生物活細胞檢測中的應用。

背景技術：

人體細胞內ph值與細胞、酶和組織的許多重要生理過程如細胞增殖和凋亡、多種藥物耐藥性、離子運輸、內吞作用和肌肉收縮等活動都密切相關。通過間隙連接和信號通路的變化，ph的變化還會影響到突觸傳遞、神經元興奮性和細胞間耦合等神經系統活動。不正常的細胞功能、生長和分裂通常與不正常的ph值直接或者間接有關，并易引發如癌癥和阿爾茨海默綜合癥等疾病。

在正常情況下，細胞液中氫離子的濃度的正常值在40nmol/l左右，即ph為7.4，大約有5nmol/l的變動(ph7.35-7.45)。0.1-0.2個ph單位的上下波動就可能導致心肺和神經系統的疾病，如阿爾茨海默綜合癥，嚴重的甚至可能危及生命。人體最佳的ph值是在7.35-7.45左右，呈弱堿性，因為這時的細胞活性最強，器官運行最正常。如果值低于此值，則人體細胞、各種酶和激素的活性將受到極大的抑制，導致組織器官功能下降，人體免疫降低等，會引發各種疾病，如：1)使人體細胞發生突變和老化；2)酸性物質容易在血管內堆積，形成脂肪肝、高血脂、痛風并引發其它心腦血管?。?)人體值每下降0.1個單位，胰島素利用率就下降30％，容易產生糖尿病與引發并發癥；4)酸性體質還會使人體內的自由基大量增加，不利于鈣的吸收，造成骨質疏松癥；5)易導致癌變。癌細胞活性在ph值6.8-6.95時最強，而且也必須在酸性條件下，才能進行轉移，所以酸性體質是產生癌癥的主要原因，同時它會使人體免疫細胞的功能下降25％左右，極大削弱了對抗癌細胞的能力。另外，有一些細胞器內部的正常即為酸性，在4-6之間，如核內體和植物液泡。在細胞生物學中，在ph值為7.0時，蛋白質變性或酶和蛋白質功能作用緩慢，低ph值可起到使蛋白質變性或激活酶和蛋白質功能的作用。例如，溶酶體中的酸性環境(ph4.5-5.5)，可以促進蛋白質在細胞代謝過程中的降解。因此細胞功能障礙往往與細胞器中ph值異常有關。

目前，許多方法可用于檢測ph。比如微電極、核磁、吸收及熒光光譜方法。在這些方法中，熒光法由于其非入侵的性質、高的靈敏度和專一性，以及廣泛可用的熒光染料在測定ph時比其他方法更為優越。而且，熒光顯微成像技術通過使用熒光ph探針能夠捕捉到細胞內氫離子的時空分辨。

通常，兩類適用于不同ph范圍的ph熒光探針的報道較多。一類如下所示的探針a(jamchemsoc.2007；129:1894-1895)和b(orglett.2004；6:2757-2760)被用于細胞質中，適用于ph范圍在6.80-7.40，還有一類如探針c(newjchem.2010；34:656)，被用于酸性細胞器(如溶酶體)中，使用ph范圍為4.50-6.00。

然而，幾乎沒有關于適用于極酸性條件下(ph<4)的ph探針的研究。盡管大多數活的物種幾乎不能存活在高度酸性的條件下，但是大量的微生物如嗜酸性菌，腸道病原體和幽門螺桿菌特別喜歡惡劣的酸性環境。因此，開發有效的適用于在極高的酸性條件下檢測細胞內ph值的ph熒光探針是很有意義和實用價值的。

技術實現要素：

本發明的課題在于提供在水相中有較大的溶解性且可以作為高靈敏度的ph熒光探針而加以利用的化合物。具體地說，本發明的課題是提供一種化合物，該化合物可以在水相中特異性捕捉氫離子，捕捉后絡合物與絡合前的化合物的熒光特性相差較為明顯且有規律，可以作為ph熒光探針而加以利用。再者，本發明另外的課題在于提供含有具有上述特征的化合物的ph熒光探針以及使用該ph熒光探針的水相中ph值的測定方法。

本發明者為了解決上述課題，經過研究，發現了以4-(2-惡唑基)吡啶為取代基的化合物對氫離子具有高的特異性，捕獲氫離子，絡合物的熒光特性較未絡合前有明顯的變化。本發明者進一步研究發現，發現了用下述通式(i)表示的化合物能迅速地形成和氫離子的絡合物，熒光特性發生明顯變化。此外化合物中如通式(ia)所示的柔性基團極大得增強了化合物在水相中的溶解性，大大增大了其于水相中ph值檢測的實際應用價值。

即，本發明提供了用下述通式(i)表示的化合物：

{式中，r1、r2和r3分別獨立地表示鹵原子、氫原子、烷基、烷氧基或者用下述式(ia)的基團

[式中，m表示0、1或者2，r4表示氫原子、烷基、烷氧基或者用下述式(ib)表示的基團；y表示亞甲基、氧原子或者氮原子和下述式(ib)表示的基團所連接的形成的基團

(式中，r5表示氫原子、烷基或者烷氧基；z1、z2和z3分別獨立地表示沒有或者氧原子，n、o和p分別獨立地表示0、1或者2),y表示亞甲基、氧原子或者氮原子和通式(ib)表示的基團所連接的形成的基團]，r1、r2和r3不能同時是鹵原子、氫原子、烷基或者烷氧基；x表示ch＝ch(即和兩側苯環形成二苯乙烯結構)或者沒有(即為聯苯結構)}。

作為上述發明優選的方式，提供用下述通式(ii)表示的化合物

式中，r6和r7分別獨立地表示鹵原子、氫原子、烷基或烷氧基；r8表示表示氫原子、烷基或者烷氧基；x1表示ch＝ch(即和兩側苯環形成二苯乙烯結構)或者沒有(即為聯苯結構)。根據本發明的優選方式，可以提供r6和r7同時是甲基，r8是甲氧基的化合物。

另外，根據本發明，可以提供用下述通式(iii)表示的化合物

[式中，r9和r10分別獨立地表示鹵原子、氫原子、烷基或烷氧基；r11和r12分別獨立地表示氫原子、烷基、烷氧基或者用下述式(iiia)表示的基團

(式中，r13表示氫原子、烷基或者烷氧基；z4、z5和z6分別獨立地表示沒有或者氧原子，r、s和t分別獨立地表示0、1或者2)，x2表示ch＝ch(即和兩側苯環形成二苯乙烯結構)或者沒有(即為聯苯結構)；q表示1或者2]。根據本發明優選方式，可以提供r9和r10同時是氫原子，r13為甲氧基的化合物。

更多的，根據本發明，可以提供含有上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物的ph熒光探針；以及由上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物和氫離子形成的絡合物。該ph熒光探針可以用于測定強酸性水溶液、細胞和組織內的ph值。

更進一步，根據本發明，可既提供了水相中ph值的測定方法，也提供了將用上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物用作ph熒光探針的方法；水相中ph值得測定方法，其特征在于包含以下工序：(a)使上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物和氫離子反應的工序，以及(b)測定在上述工序中生成的氫絡合物的熒光強度的工序；并且將上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物用作ph熒光探針。

用上述通式(i)、通式(ii)或者通式(iii)表示的化合物作為用于制造上述ph熒光探針的中間體是有用的。

本說明書中，“烷基”或者“烷氧基”的烷基部分是指例如碳原子數為1-10個，優選碳原子數1-6個，優選碳原子數1-4個的直鏈、支鏈、環狀、或者它們組合形成的烷基。更具體地說，作為烷基，優選低級烷基(碳原子數1-6個的烷基)。作為低級烷基，例如可以列舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、環丙基甲基、正戊基、正己基、環己基等。在本說明書中，有鹵素原子的情況下，氟原子、氯原子、溴原子或者碘原子都可以，優選氟原子或氯原子。

在用上述通式(i)表示的化合物中，x優選為ch＝ch(即和兩側苯環形成二苯乙烯結構)或者沒有(即和兩側苯環形成聯苯結構)。在用上述通式(i)表示的化合物中，優選r1、r2和r3之一是用式(ia)表示的基團，另外兩個為鹵原子、氫原子、烷基、或者烷氧基。r2在x表示的基團對位的時候，優選r1和r3同時為鹵原子、氫原子、烷基、或者烷氧基。在用式(ia)表示的基團中，m優選為0、1或2，r4優選為烷基、烷氧基或由式(ib)表示的基團。在活細胞造影中，r4優選為由式(ib)表示的基團。對于y，優選為氧原子或者氮原子和用式(ib)表示的基團共價鍵和形成的基團。優選y為氧原子時，在用式(ib)表示的基團中，z1和z2優選為氧原子，優選n和o為2，p為1；優選y為氮原子和用式(ib)表示的基團共價鍵和形成的基團時，在r4優選的式(ib)表示的基團中，z1和z2優選為氧原子，優選n為2，o為1，p為0，y中含有的用式(ib)表示的基團中，z1和z2優選為氧原子，z3優選為沒有，優選n和o為2，p為1。r5優選為烷基或者烷氧基，另外在活細胞熒光造影的用途中，優選r5為甲氧基。

在用上述同時(ii)表示的化合物中，優選r6和r7同時是甲基，r8是甲氧基。

在用上述通式(iii)表示的化合物中，優選r9和r10同時為氫原子，r11和r12為用式(iiia)表示的基團。在優選r11為通式(iiia)表示的基團中，優選r為2，s為1，t為0，z4和z5優選為氧原子；優選r12為通式(iiia)表示的基團中，優選r為2，s為1，t為1，z4、z5和z6優選為氧原子；在通式(iiia)表示的基團中，優選r13為烷基或者烷氧基，另外在活細胞熒光造影的用途中，優選r5為甲氧基。優選x2為ch＝ch(即和兩側苯環形成二苯乙烯結構)或者沒有(即和兩側苯環形成聯苯結構)。

用上述通式(i)、(ii)和(iii)表示的本發明的化合物根據取代基的種類，有具有1個或2個以上不對稱碳原子的情況，不僅基于1個或2個以上不對稱碳原子的光學活性體或給予2個以上不對稱碳原子的非對映異構體等的立體異構體、并且立體異構體的任意混合物、外消旋體等都包含在本發明的范圍內。

自鹵代的α-溴代苯乙酮(hai為鹵素)出發，由已知文獻方法(angew.chem.2012；51(11):2673-6)，經由德爾濱反應生成芐胺，再和異煙酸在三氯氧磷回流的條件下扣環，形成鹵代的4-(5-苯基-2-惡唑基)吡啶化合物，再根據文獻方法，如suzuki和heck反應，和取代(3、4和5號位)的苯硼酸或者苯乙烯化合物形成聯苯或者苯乙烯基團的取代，即得到部分通式(i)產物；或者，在產物的基礎上脫甲基制備帶有羥基的中間體，然后進行成醚、環氧加成、邁克爾共軛加成反應等，得到另一部分通式(i)產物。

作為對所述通式(i)的優選方式，通式(ii)和通式(iii)所述化合物的優選性體現在如上述通式(i)所述化合物合成方法中取代苯硼酸和取代苯乙烯中的r2基團的差異性，根據帶有胺基和羥基的柔性鏈的取代反應，可以較為輕易地制備得到通式(ii)和(iii)所需的取代苯硼酸和苯乙烯中間體，后續合成方式參照通式(i)，即可得到通式(ii)和通式(iii)的化合物。

另外，在本說明書的實施例中，更詳細且具體地顯示了記載在該方案中的示例性化合物的制造方法。因而，本領域技術人員根據這些說明，適當選擇反應原料、反應條件和反應試劑等，更具需要，通過對這些合成方法進行修改或者改變，全都可以制造上述通式表示的本發明的化合物。

符合通式(i)結構的示例性化合物列舉如下：

用上述通式(i)、通式(ii)和通式(iii)表示的本發明的化合物作為熒光探針是有效的。用上述通式(i)、通式(ii)和通式(iii)表示的本發明的化合物和氫離子的絡合物的熒光性質較其本身的熒光性質發生較大變化，且它們熒光性質隨著氫離子絡合程度的不同呈現出有規律性的變化。上述化合物在水溶液中具有較大的溶解性且具有可以特異性捕獲氫離子并形成絡合物的特征。形成的絡合物還具有在活的細胞中產生熒光的特征。因此，用上述通式(i)、通式(ii)和通式(iii)表示的本發明的化合物作為在生理條件下測定生物細胞和生物組織中的ph值的ph熒光探針是極其有用的。另外，本說明書中使用的所謂“測定”屬于包括定性和定量測定，應該作最廣義的解釋。

本發明的ph熒光探針的使用方法沒有特別的限定，可以和以往公知的ph探針同樣使用。通常，將選自用上述(i)表示的化合物溶解在生理鹽水或緩沖液等水性介質或者乙醇、丙酮、乙二醇、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺等水混溶性有機溶劑和水性介質的混溶物等中，將該溶液添加到含有細胞和組織的適當的緩沖液中，只要測定其熒光發射譜就可以。

【附圖說明】

圖1：(a)實施例一中的探針1在水溶液中不同濃度下的紫外-可見吸收光譜；(b)探針1的最大吸收波長處的吸光度隨濃度的變化情況。

圖2：(a)實施例二中的探針2在水溶液中不同濃度下的紫外-可見吸收光譜；(b)探針2的最大吸收波長處的吸光度隨濃度的變化情況。

圖3：(a)實施例三中的探針3在水溶液中不同濃度下的紫外-可見吸收光譜；(b)探針3的最大吸收波長處的吸光度隨濃度的變化情況。

圖4：(a)實施例四中的探針4在水溶液中不同濃度下的紫外-可見吸收光譜；(b)探針4的最大吸收波長處的吸光度隨濃度的變化情況。

圖5：實施例一中的探針1在生物體外不同ph值的水溶液中與各種金屬離子作用的熒光柱形圖。

圖6：實施例一中探針1在不同ph值水溶液中的熒光光譜；插入圖：探針1在ph2.0-5.5范圍內熒光強度比值i405/i450與ph值的變化曲線。

圖7：實施例二中探針2在不同ph值水溶液中的熒光光譜；插入圖：探針2在ph3.0-4.0范圍內熒光強度比值i390/i520與ph值的變化曲線。

圖8：實施例三種探針3在不同ph值水溶液中的熒光光譜；插入圖：探針3在ph2.4-6.0范圍內500nm處熒光強度與ph值的變化曲線。

圖9：實施例四種探針4在不同ph值水溶液中的熒光光譜；插入圖：探針4在ph2.0-5.17范圍內450nm處熒光強度與ph值的變化曲線。

圖10：實施例一中探針1在活hela細胞中的熒光成像照片；(a)以ph＝6.6的檸檬酸緩沖液培養30min的熒光像；(d)(a)的明場像；(b)以ph＝4的檸檬酸緩沖液培養30min的熒光像；(e)(b)的明場像；(c)以ph＝3的檸檬酸緩沖液培養30min的熒光像；(f)(c)的明場像。

圖11：實施例二中探針2在活hela細胞中的熒光成像照片。

圖12：實施例三中探針3在活hela細胞中的熒光成像照片。

圖13：實施例四中探針4在活hela細胞中的熒光成像照片。

【具體實施方式】

實施例一：探針probe1的合成

自三乙二醇單甲醚為原料，根據文獻方法，經過三步，可以輕易得到化合物3，為褐色粘稠液體狀產物。收率79.9％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):7.14(t,j＝7.8hz,2h),7.01(d,j＝8.9hz,4h),6.92(d,j＝7.9hz,2h),6.84(s,1h),6.82(d,j＝8.9hz,4h),4.11-4.08(m,4h),3.85-3.82(m,4h),3.73(dd,j＝5.9,3.5hz,4h),3.69-3.63(m,8h),3.55(dd,j＝5.6,3.6hz,4h),3.37(s,6h).

在250ml的圓底燒瓶中，加入n,n-二甲基甲酰胺(1.15g，16mmol)，在0℃(冰水浴)的條件下用注射器注入三氯氧磷(2.5g，16mmol)，攪拌反應1h，將中間體3(3.6g，11mmol)溶解在100ml三氯甲烷中，加入反應體系，升溫至100℃，反應5h，反應結束后冷卻至室溫，將反應物倒入冰水中，以20％naoh水溶液中和ph至7，用二氯甲烷(50ml×3)萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干除去溶劑，用乙酸乙酯/石油醚(2:1)作為展開劑，經硅膠柱層析得到化合物4(2.8g)。淡黃色粘稠產物。收率48.8％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):9.75(s,1h),7.62(d,j＝8.5hz,2h),7.11(d,j＝8.7hz,4h),6.90(d,j＝8.7hz,4h),6.84(d,j＝8.4hz,2h),4.13(t,j＝4.3hz,4h),3.87(t,j＝4.8hz,4h),3.76-3.73(m,4h),3.71-3.65(m,8h),3.57-3.53(m,4h),3.38(s,6h).

在250ml單口燒瓶中，依次加入中間體3(4.6g，11mmol)、n-溴代丁二酰亞胺(1.96g，11mmol)和50mln,n-二甲基甲酰胺，在室溫下攪拌反應4h。加入冰水，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸干溶劑，用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作為展開劑，經硅膠柱層析得到化合物5(2.2g)。淡黃色液體產物。收率30.9％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):7.26-7.18(m,2h),7.00(d,j＝8.8hz,4h),6.83(d,j＝8.8hz,4h),6.78(d,j＝8.8hz,2h),4.13-4.07(m,4h),3.87-3.82(m,4h),3.76-3.71(m,4h),3.71-3.63(m,8h),3.57-3.54(m,4h),3.38(s,6h).

在500ml單口燒瓶中，依次加入2,4'-二溴苯乙酮(32.57g，117.2mmol)、六次甲基四胺(16.5g，117.9mmol)和300ml三氯甲烷，室溫下攪拌反應24h，過濾，搗碎濾餅，用三氯甲烷洗滌多次，取固相放置真空烘箱干燥12h，得47.38g白色固體。取白色固體于500ml三口燒瓶中，接一玻璃三通接頭(接頭連接氮氣球)，用油泵對燒瓶抽真空，然后通過接頭通入氮氣，如此再重復2次，盡可能除去燒瓶內空氣。在0℃條件下分散在200ml乙醇中，然后在攪拌下以注射器分次加入150ml濃鹽酸(每次注入10ml，間隔2min)。然后在0℃條件下攪拌反應1h，再置于室溫反應24h。反應結束后，抽濾除去白色沉淀物，取濾液，旋干得淡黃色固體，在真空中干燥得到化合物6(15.74g)。淡黃色固體。收率53.6％。¹hnmr(400mhz,d6-dmso,δppm):8.51(d,j＝43.0hz,3h),7.98(d,j＝8.4hz,2h),7.83(d,j＝8.4hz,2h),4.62(d,j＝5.3hz,2h).

在500ml三口燒瓶中，依次加入中間體6(15.74g，62.7mmol)和異煙酸(11.75g，95.5mmol)，連接干燥好的冷凝管，于冷凝管口接一玻璃三通接頭(接頭連接氮氣球)，用油泵對燒瓶抽真空，然后通過接頭通入氮氣，如此再重復2次，盡可能除去燒瓶內空氣和水分。以注射器加入pocl3(70ml)，升溫至回流溫度反應6h。反應結束后，冷卻至室溫，旋蒸掉剩余的pocl3。向燒瓶內加入etoh：h2o＝2:1(v/v)的混合液體，使其全部分散在液體中，倒入500ml燒杯，用質量比為20％的naoh水溶液輔以nahco3中和溶液的ph至10左右，過程中注意控溫，溫度升得較高(30℃-40℃)時將燒杯置入冰水中降溫。用二氯甲烷(70ml×3)萃取，合并有機相，用無水na2so4干燥然后過濾，收集濾液，將濾液旋蒸后得粗產物，粗產物用柱層析法提純(洗脫劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶劑，體積比為1:3)得到化合物7(1.20g)。淡黃色固體產物，收率6.7％。¹hnmr(400mhz,d6-dmso,δppm):8.79(d,j＝5.9hz,2h),8.03(s,1h),8.01(dd,j＝4.7,1.3hz,2h),7.85(d,j＝8.5hz,2h),7.73(d,j＝8.5hz,2h).

在100ml三口燒瓶中，依次加入中間體9(60mg，0.20mmol)、分子qs-1(90mg，0.15mmol)，無水碳酸鉀(70mg，0.51mmol)，甲基三辛基氯化銨(0.4ml)和25mln,n-二甲基甲酰胺，連接干燥好的冷凝管，于冷凝管口接一玻璃三通接頭(接頭連接氮氣球)，用油泵對燒瓶抽真空，然后通過接頭通入氮氣，如此再重復2次，以錫箔紙包住燒瓶保證避光條件，迅速稱取雙(三苯基膦)二氯化鈀(30mg，0.043mmol)，迅速倒入燒瓶內，用油泵對燒瓶抽真空，通過接頭通入氮氣，如此再重復2次。加熱到160℃，反應24h，冷卻至室溫，減壓蒸餾除去大部分n,n-二甲基甲酰胺，用柱層析法提純(洗脫劑為乙酸乙酯)得到探針1(80.0mg)。棕褐色粘稠油狀液體。收率65.6％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):8.67(d,j＝4.7hz,2h),7.86(d,j＝5.8hz,2h),7.61(d,j＝8.3hz,2h),7.47(d,j＝8.4hz,2h),7.42(s,1h),7.26(d,j＝8.6hz,2h),7.02(d,j＝16.3hz,1h),6.97(d,j＝8.9hz,4h),6.86(d,j＝16.7hz,1h),6.82(d,j＝8.6hz,2h),6.77(d,j＝8.9hz,4h),4.07-3.98(m,4h),3.80-3.74(m,4h),3.67(dd,j＝5.8,3.4hz,4h),3.64-3.55(m,8h),3.48(dd,j＝5.6,3.6hz,4h),3.30(s,6h).hrms(m+h)forc48h53n3o9:816.3860(calculated),816.3866(experimental)；(m+na)forc48h53n3o9:838.3680(calculated),838.3675(experimental)。

實施例二：探針probe2的合成

在250ml單口燒瓶中，依次加入中間體3(4.6g，11mmol)、n-溴代丁二酰亞胺(1.96g，11mmol)和50mln,n-二甲基甲酰胺，在室溫下攪拌反應4h。加入冰水，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋蒸干溶劑，用乙酸乙酯/石油醚(1:1)作為展開劑，經硅膠柱層析得到探針1(2.2g)。淡黃色液體產物。收率30.9％。¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):7.26-7.18(m,2h),7.00(d,j＝8.8hz,4h),6.83(d,j＝8.8hz,4h),6.78(d,j＝8.8hz,2h),4.13-4.07(m,4h),3.87-3.82(m,4h),3.76-3.71(m,4h),3.71-3.63(m,8h),3.57-3.54(m,4h),3.38(s,6h).

在100ml單口燒瓶中，取50ml干燥的四氫呋喃溶解中間體8(2.0g，3.1mmol)并將其加入燒瓶，將體系溫度降至-78℃，在氮氣保護下加入正丁基鋰溶液(8ml，2.5m)，攪拌2h，加入硼酸三異丙酯(0.88g，4.7mmol)，攪拌反應8h。反應結束后，反應液倒入100ml冰水中，加入鹽酸保證體系為酸性，用二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶劑，得到粗產品。用乙酸乙酯/甲醇(20:1)作為展開劑，經硅膠柱層析得到化合物9(1.3g)。淡黃色粘稠液體。收率68.8％。¹hnmr(400mhz,d6-dmso,δppm):7.76(s,2h),7.59(d,j＝8.5hz,2h),7.01(d,j＝8.9hz,4h),6.92(d,j＝9.0hz,4h),6.68(d,j＝8.5hz,2h),4.08-4.04(m,4h),3.77-3.69(m,4h),3.59(dd,j＝5.8,3.2hz,4h),3.56-3.50(m,8h),3.43(dd,j＝5.8,3.6hz,4h),3.23(s,6h).

在100ml三口燒瓶中，化合物7(200mg，0.67mmol)、化合物9(400mg，0.67mmol)，無水碳酸鉀(300mg，2.2mmol)，甲基三辛基氯化銨(0.4ml)、甲苯、乙和水各7.5ml、4.5ml和1.5ml。連接干燥好的冷凝管，于冷凝管口接一玻璃三通接頭(接頭連接氮氣球)，用油泵對燒瓶抽真空，然后通過接頭通入氮氣，如此再重復2次，以錫箔紙包住燒瓶保證避光條件，迅速稱取四(三苯基膦)鈀(30mg，0.026mmol)，迅速倒入燒瓶內，用油泵對燒瓶抽真空，通過接頭通入氮氣，如此再重復2次。加熱到100℃，反應24h，冷卻至室溫，將反應液倒入100ml水中，用乙酸乙醋萃取，旋蒸有機相除去溶劑，得到粗產品。用乙酸乙酯/石油醚(3:1)作為展開劑，走柱得到探針2(280mg)。淡黃色粘稠液體。收率52.8％。¹hnmr(400mhz,d6-dmso,δppm):8.78(dd,j＝4.6,1.5hz,2h),8.01(dd,j＝4.6,1.5hz,2h),7.98(s,1h),7.92(d,j＝8.4hz,2h),7.76(d,j＝8.5hz,2h),7.59(d,j＝8.7hz,2h),7.05(d,j＝8.9hz,4h),6.95(d,j＝9.0hz,4h),6.85(d,j＝8.7hz,2h),4.11-4.05(m,4h),3.77-3.71(m,4h),3.59(dd,j＝5.9,3.2hz,4h),3.57-3.50(m,8h),3.45-3.41(m,4h),3.24(s,6h).hrms(m+h)forc46h51n3o9:790.3703(calculated),790.3705(experimental)；(m+na)forc46h51n3o9:812.3523(calculated),812.3519(experimental)。

實施例三：探針probe3的合成

與上述實施例一相同的合成方法，以3,5-二甲基-4-羥基苯甲醛為原料，得探針3(淡黃色粘稠液體)。收率66.0％。

¹hnmr(400mhz,cdcl3,δppm):8.76(d,j＝6.0hz,2h),8.02-7.89(m,2h),7.74-7.68(m,2h),7.60-7.54(m,2h),7.52(s,1h),7.20(s,2h),7.12-6.96(m,2h),4.01-3.94(m,2h),3.90-3.81(m,2h),3.79-3.75(m,2h),3.74-3.65(m,4h),3.61-3.52(m,2h),3.41-3.37(m,3h),2.34(d,j＝11.2hz,6h).hrms(m+h)forc31h34n2o5:515.2546(calculated),515.2549(experimental)；(m+na)forc31h34n2o5:537.2366(calculated),538.2363(experimental)。

實施例四：探針probe4的合成

與上述實施例二相同的合成方法，以2,5-二甲基-4-溴苯酚為原料，得探針4(淡黃色粘稠油狀液體)。收率90.1％。

¹hnmr(400mhz,d6-dmso,δppm):8.79(d,j＝5.5hz,2h),8.02(d,j＝7.4hz,3h),7.94(d,j＝8.2hz,2h),7.78(d,j＝8.2hz,2h),7.41(s,2h),3.96-3.89(m,2h),3.77-3.71(m,2h),3.66-3.60(m,2h),3.60-3.52(m,4h),3.48-3.42(m,2h),3.25(s,3h),2.31(s,6h).hrms(m+h)forc29h32n2o5:489.2389(calculated),489.2383(experimental)；(m+na)forc29h32n2o5:512.2209(calculated),512.2212(experimental)。

實施例五：水溶性實驗

使用在上述實施例一中得到的探針1、實施例二中得到的探針3、實施例三中得到的探針3和實施例四中得到的探針4，根據吸光度法來評價其溶解能力。首先分別將探針1、探針2、探針3和探針3溶解在二甲亞砜中配制備成1.0×10^-3m的母液，然后逐步稀釋，獲得一系列不同的母液。然后通過微量注射器加入到含3ml蒸餾水的石英比色皿中。在所有情況中，二甲亞砜在水中的量為0.2％(即每次注入6μm的探針分子母液)。這樣可以保證二甲亞砜的存在不會影響探針分子在純水中的溶解性。探針1、探針2、探針3和探針4的結果分別示于圖1、圖2、圖3和圖4。圖中，(a)圖均代表不同濃度下對應的化合物的紫外-可見吸收譜；(b)圖均代表對應的化合物最大吸收波長處的吸光度隨對應的化合物的濃度的變化情況，對于探針1、探針2、探針3和探針4，這個波長分別為413nm、393nm、358nm和358nm。

視圖1至圖4中各(b)圖中線性區域最大處的濃度為溶解度，探針1、探針2、探針3和探針4在水中的溶解度分別為30μm、20μm、13.3μm和13.3μm。這樣具有柔性親水的的聚乙二醇鏈的化合物在水溶液中具有很大的溶解度，對于它們用于檢測水相環境中的ph值和對活的細胞或者生物組織的染色是非常有利的。

實施例六：離子選擇性實驗

使用上述實施例一中得到的探針1，評價其對氫離子的選擇性，將5μm探針1分別加到含有各種金屬離子(25mmna⁺，5mmk⁺，ca²⁺；0.1mmmg²⁺，mn²⁺，fe²⁺，ni²⁺，pb²⁺，cu²⁺，cr²⁺)的不同ph值(ph為6.6或3.0)的水溶液中，測定熒光發射譜。結果示于圖5。

圖中，縱軸為探針1在不同ph值且含有不同金屬離子的水溶液中發射譜中405nm處和450nm處熒光發射強度的比值。本發明的探針1對氫離子具有極高的選擇性，即該探針對氫離子有極強的選擇性，即使在生物體內大量存在的鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子以高濃度存在的條件下，熒光強度比值變化也極小。另外，也可以看到其他的金屬離子對該探針分子的熒光性質影響也很小。

本發明的化合物均以4-(5-苯基-2-惡唑基)吡啶為質子化位點，對氫離子的選擇性應該表現出類似的性質，為高選擇性的ph探針。

實施例七：熒光滴定實驗

探針1、探針2、探針3和探針4對ph值的檢測可以通過熒光滴定實驗及其熒光性質(對于探針1，為兩波長處的熒光發射強度比值，對于探針2、探針3和探針4為某一波長處的熒光發射強度，這一波長為最大發射波長附近)隨ph值的變化曲線來研究，結果分別示于圖6、圖7、圖8和圖9。結果表明探針1適合于檢測ph范圍為3.5-4.4環境中的ph值。根據henderson-hasselbatchtype方程(log[(imax-i)/(i-imin)]＝pka-ph)，計算出探針探針1的pka值為3.95；探針2適合于檢測ph范圍為3.0-4.0條件下的ph值且其pka值為3.35；探針3適合于檢測ph范圍為3.2-4.8條件下的ph值且其pka值為4.00；探針4適合于檢測ph范圍為3.1-4.1條件下的ph值且其pka值為3.65。因而，本發明的化合物的熒光性質在某一ph范圍內，均能隨著ph的變化體現出規律性的變化，可以用于檢測酸性條件下的ph值。

實施例八：活生物細胞熒光成像

應用上述探針1、探針2、探針3和探針4進行活細胞中的熒光造影。hela細胞均按照規定(atcc,manassas,va,usa)進行培養。細胞培養在dmem培養基中，培養基中加入10％fbs緩沖液，加入青霉素100units/ml，鏈霉素100μg/ml，于37℃的5％co2培養箱中。成像兩天前，將hela細胞接種在培養皿中的無菌蓋玻片上使其貼壁24h后，除去未貼壁細胞。實驗之前用dmso溶解探針ai得到濃度為5mm的儲備液。分別取0.5μl探針(5mm，dmso)加入含有貼壁細胞的培養基(500μl)使其終濃度為5μm，置于37℃的5％co2培養箱中培育30min后，用檸檬酸鹽緩沖液(ph＝6.6)輕輕清洗3次，以除去培養基中過量的未進入細胞的探針。將細胞固定后在激光共聚焦顯微鏡下，通過線性掃描進行熒光光成像。

上述探針1、探針2、探針3和探針4在不同ph值(6.6、4.0和3.0)條件下的活細胞熒光圖分別如圖10、圖11、圖12和圖13所示。細胞均發出藍色熒光，隨著細胞所處ph值的下降，發出的藍色熒光強度均表現出明顯的減弱，表明上述化合物對活細胞環境的ph變化是很敏感的，所以作為測定ph值的熒光探針是極有用的。

需要強調的是，上述列舉的實施例僅是一些示例性試驗，不應被視為是限定性試驗或條件。本發明申請所涵蓋的創新范圍應以權利要求書記載為準。