本發明屬于微生物領域，具體涉及一種發酵巨菌草生物基及其制備方法。
背景技術：
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巨菌草(pennisetumgiganteumz.x.lin)是多年生禾本科直立叢生型植物，粗蛋白和糖分含量高。巨菌草經過接種植物乳桿菌、副干酪乳桿菌等菌種發酵后，ph值降低、乳酸、乙酸等成分增加，乳酸菌菌數同時大量增加，有效的提高了巨菌草的使用價值。發酵后的巨菌草可整包投入養殖水體中，其作用是，發酵巨菌草含有大量兼性厭氧的益生菌，在水體環境中可利用巨菌草中的蛋白質、糖分以及池塘中有機物等成分進行繁殖生長，有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽、抑制水體中藻類生長，同時促進水體中其他微生物的生長，改善水質。
植物乳桿菌和副干酪乳桿菌是我國農業部允許作為飼料添加劑的菌株之一,其已被越來越多地研制成飼用微生物制劑。
發酵巨菌草生物基是以具有活性乳酸菌的巨菌草為主要成分，通過簡單，易于工業化生產的生產工藝，制備一種水產養殖用益生菌制劑。本發明創造的產品能有效降解養殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽，抑制水體中藻類生長，減少抗生素的使用，促進水產養殖業的健康發展。
技術實現要素：
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本發明的是提供一種有效活性乳酸菌菌數高的發酵巨菌草生物基及其制備方法。
本發明的發酵巨菌草生物基是通過以下方法制備的，其包括以下步驟：
將混合菌液添加到巨菌草草料上，接種量為每kg草料30-100g混合菌液，密封發酵，在溫度為20-35℃下發酵10-30天，至發酵草料的ph值達到3.5-4.5之間時，發酵結束，由此得到發酵巨菌草生物基；
所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌5×107-1×109個和植物乳桿菌9×107-1.25×109個。
所述的巨菌草草料是將新鮮收割的巨菌草成熟菌株粉碎至3-10cm而得到。
本發明的發酵巨菌草生物基，其有效活性乳酸菌菌數在5×108-5×109cfu/g，能夠在養殖水體中利用巨菌草中的蛋白質、糖分以及池塘中有機物等成分進行繁殖生長，有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽、抑制水體中藻類生長，改善水質，減少抗生素的使用，促進水產養殖業的健康發展。
具體實施方式：
以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
實施例1發酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取副干酪乳桿菌菌種的單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的30l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數75％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0左右，此發酵液即為第二級種子液。
將上述30l的第二級種子液以8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的300l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數80％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0，得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發酵液活菌數。
(2)按照與上述副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
1、改良mc培養基：
加水至1000ml，調節ph至6.0±0.2。固體培養基加質量分數2％瓊脂。滅菌備用
2、糖蜜液體培養基：
加水至1000ml，調節ph至6.8±0.2，滅菌備用。
(3)發酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至3cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比1：9比例混合的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌5×107個，植物乳桿菌9×107個，接種量為每kg草料接種30g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發酵袋，每袋裝30kg，置于20攝氏度下發酵30天。期間檢測物料ph值以及活菌數。待ph4.5時發酵結束，由此得到發酵巨菌草生物基，最后成品陰涼處儲存。測得植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數達到5×108cfu/g，
(4)發酵巨菌草生物基活菌數的測定
1平板菌落計數法
1.1稱取發酵巨菌草生物基樣品10g，放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，搖床200rpm振蕩20min，靜置20～30s，制成樣品懸液。
1.2用1ml無菌吸管吸取1ml樣品懸液，放入盛有9ml滅菌水的試管中，充分振搖使混合均勻，即制成1：100均勻稀釋液。
1.3用1ml無菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌水試管內，振搖試管，混合均勻，做成1：1000的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液，分別制成10-4、10-5、10-6……10-9梯度稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。
1.4選擇2-3個適宜稀釋度(一般取10-6、10-7、10-8)，用滅菌100μl微量移液器，各取0.1ml注射至滅菌的空白平板上，用無菌推棒均勻涂于整個表面，然后倒入已經冷卻至45℃左右的改良mc培養基，每個稀釋度做3個平板。
1.5將平皿倒置于37℃±1℃恒溫培養箱內培養48h±2h后，選取菌落數在30-300之間的平板計數。
2植物乳桿菌、副干酪乳桿菌菌落形態
形態特征：植物乳桿菌落凸起，呈圓形，表面光滑，細密，呈米白色或淺黃色；副干酪乳桿菌菌落白色或灰白色，圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊、凸起。
3菌落計數
3.1稀釋度的選擇
3.1.1應選擇平均菌落在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數報告之
3.1.2若有兩個稀釋度。其生長的菌落數均在30-300之間，則視兩者之間如何來決定若其比小于或等于2，應報告其平均數；若大于2，則報告其中較小的數字。
3.1.3若所有稀釋度的平均菌落數均大于300。則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
3.1.4若所有稀釋度平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
3.2計算：
植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數(cfu/g)＝同一稀釋度三個平板菌落平均數×稀釋倍數×10
(5)發酵巨菌草生物基在水產養殖中的應用效果
將上述所得的發酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入黃顙魚養殖塘中，每個月使用一次，養殖池塘水深1.5m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph8.2，氨氮初始濃度為0.55mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.65mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.2mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.1mg/l，氨氮降解率為63.63％，亞硝酸鹽降解率為84.61％。
實施例2發酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取菌種的副干酪乳桿菌單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養基(同實施例1)的250ml三角瓶中，37℃靜置培養24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的30l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數75％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0左右，得到第二級種子液。
將上述30l的第二級種子液以體積分數8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的300l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數80％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0，得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發酵液活菌數。
(2)按照與副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
(3)發酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至6cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比3：7的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌3×108個，植物乳桿菌7×108個，接種量每kg草料接種60g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發酵袋，每袋裝40kg，置于28攝氏度下發酵20天。期間檢測物料ph值以及活菌數。待ph4.0時發酵結束，由此得到發酵巨菌草生物基，最后成品陰涼處儲存。測得發酵巨菌草生物基中植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數達到1.0×109cfu/g。
(4)發酵巨菌草生物基在水產養殖中的應用效果
將上述所得的發酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入草魚養殖塘中，每個月使用一次，養殖池塘水深1m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph8.0，氨氮初始濃度為0.52mg/l，亞硝酸鹽濃度為1.65mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.1mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.3mg/l，氨氮降解率為80.76％，亞硝酸鹽降解率為81.82％。
實施例3發酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取菌種的副干酪乳桿菌單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的30l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數75％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0左右，由此得到第二級種子液。
將上述30l的種子液以體積分數8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養基的300l種子罐中進行發酵，裝液量為體積分數80％，發酵溫度37℃，靜置培養，培養至發酵液ph為4.0，由此得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發酵液活菌數。
(2)按照與副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
(3)發酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至10cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比5：5的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌1×109個，植物乳桿菌1.25×109個，接種量每kg草料接種100g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發酵袋，每袋裝50kg，置于35攝氏度下發酵10天。期間檢測物料ph值以及活菌數。待ph3.5發酵結束，由此得到發酵巨菌草生物基，測得此發酵巨菌草生物基植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數達到5×109cfu/g。
(4)發酵巨菌草生物基在水產養殖中的應用效果
將上述所得的發酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入蝦養殖塘中，每個月使用一次，養殖池塘水深1m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph7.5，氨氮初始濃度為0.42mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.75mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.1mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.2mg/l，氨氮降解率為76.19％，亞硝酸鹽降解率為73.33％。