本發(fā)明涉及肝素鈉的制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種肝素鈉的制備方法。
背景技術(shù)：
：肝素鈉是一種酸性黏多糖，具有抗凝血的作用。肝素鈉作為一種天然抗凝血物質(zhì)，在抗凝血、促進(jìn)脂蛋白酶釋放和補(bǔ)體溶細(xì)胞體系等方面具有良好的活性，廣泛用于流行性腦炎、敗血癥、血栓塞、急性心肌梗塞、動(dòng)脈硬化等治療。肝素鈉的原料藥來(lái)源于肝素粗品。肝素粗品源自健康動(dòng)物的小腸粘膜，其中含有大量雜蛋白、雜核酸、微生物等，需經(jīng)過(guò)物理和化學(xué)提取分離過(guò)程，定向獲取天然結(jié)構(gòu)基團(tuán)完整的肝素，從而制成肝素鈉原料藥。現(xiàn)有肝素提取純化方法大多采用酸堿處理去除雜質(zhì)蛋白、核酸等物質(zhì)，采用多次氧化的方法去除色素類物質(zhì)，采用乙醇多次分級(jí)的方式去除等雜多糖。上述酸堿處理的方式易造成核酸、色素的殘留量高，導(dǎo)致后續(xù)氧化次數(shù)增多；酸處理及多次氧化易導(dǎo)致肝素鈉部分失活，難以得到高效價(jià)的肝素鈉；多次乙醇分級(jí)易造成收率降低及物料的浪費(fèi)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明目的在于：針對(duì)上述存在的問(wèn)題，提供一種肝素鈉的制備方法，從肝素鈉粗品中獲取精品肝素鈉，該方法操作簡(jiǎn)單，花費(fèi)時(shí)間短，產(chǎn)品收率高，所得產(chǎn)品光吸收率低，純度高，活性高。本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種肝素鈉的制備方法，其特征在于，其包括：粗品溶解：將粗品肝素鈉溶解于nacl溶液得到粗溶液；兩次酶解：將所述粗溶液進(jìn)行先后兩次酶解得到酶解液；鈣離子絮凝沉淀：向所述酶解液中加入鈣離子試劑，攪拌后靜置，過(guò)濾取濾液得到第一濾液；去除多余鈣離子：調(diào)節(jié)所述第一濾液ph至11-12，攪拌后靜置，過(guò)濾取濾液得到第二濾液；超濾濃縮：將所述第二濾液進(jìn)行超濾濃縮得到濃縮液；吸附層析柱脫色：將所述濃縮液上吸附層析柱脫色得到肝素鈉溶液。肝素在體內(nèi)與蛋白質(zhì)復(fù)合成復(fù)合物，復(fù)合物的抗凝性隨著其蛋白活性的去除而增強(qiáng)。本方法中，粗品肝素鈉經(jīng)過(guò)兩次蛋白酶解，將肝素鈉從蛋白質(zhì)復(fù)合物中充分游離出來(lái)，避免蛋白質(zhì)殘留影響其活性。肝素游離出來(lái)后，加入鈣離子試劑，鈣離子與蛋白質(zhì)螯合絮凝沉淀，通過(guò)離心便可出去，然后調(diào)節(jié)溶液ph使多余的鈣離子沉淀，離心除去沉淀后取濾液超濾濃縮，濃縮液經(jīng)過(guò)吸附層析柱脫色，整個(gè)過(guò)程避免多次乙醇分級(jí)沉淀，提高產(chǎn)品收率；避免氧化脫色，從而避免引入異物以及肝素鈉失活，從而提高肝素鈉的活性。同時(shí)，采用超濾以及吸附層析柱脫色兩步純化保證了產(chǎn)品的純度。發(fā)明較佳的實(shí)施例中，粗品溶解過(guò)程中，將nacl溶液加熱至30-45℃，所述nacl溶液的濃度為2％(m/v)，所述粗品肝素鈉與所述nacl溶液之比為1：5-10(kg：l)，并在30-45℃下保持4-6h。提高nacl溶液的溫度，可以提高肝素鈉在其中的溶解度和溶解速率，從而提高物料的利用率。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，兩次酶解包括第一酶解和第二酶解；第一酶解包括：調(diào)節(jié)所述粗溶液至ph為7.5-8.5并加熱至45-50℃，然后加入蛋白酶ⅰ至其在nacl溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5％，保持溶液ph為7.5-8.5、溫度45-50℃條件下攪拌4-6h得到第一酶解液。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，調(diào)節(jié)所述第一酶解液至ph為8.5-9.5并加熱至55-60℃，然后加入蛋白酶ⅱ至其在nacl溶液中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5％，溶液ph為8.5-9.5、溫度55-60℃條件下保持4-6h，調(diào)節(jié)ph至6.5-7.0并加熱至85-90℃，保溫0.5h后得到酶解液。由于采取了上述技術(shù)方案，蛋白質(zhì)復(fù)合物中的蛋白質(zhì)被酶解，其中的肝素鈉充分地游離出來(lái)，并且再經(jīng)過(guò)高溫降解成高附加值的低分子肝素。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，鈣離子絮凝沉淀過(guò)程包括向所述酶解液中加入氯化鈣至其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-3％(m/v)，攪拌均勻后靜置沉淀1-2h；過(guò)濾取濾液。由于采取了上述技術(shù)方案，鈣離子與已游離出肝素的蛋白質(zhì)螯合絮凝成沉淀，經(jīng)過(guò)1-2h充分螯合，蛋白質(zhì)全部沉淀，通過(guò)離心除去。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，將所述第二濾液調(diào)節(jié)ph至7.5-8.0，攪拌后靜置0.5h再進(jìn)行超濾濃縮。將第二濾液調(diào)節(jié)至7.5-8.0，一方面可以降低強(qiáng)堿性溶液對(duì)超濾膜的損耗，另一方面縮短肝素在強(qiáng)堿環(huán)境的時(shí)間，降低對(duì)肝素活性的影響。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，超濾濃縮過(guò)程所用超濾膜的分子量為5000-8000，并且超濾濃縮至原體積的1/8-1/5。超濾濃縮過(guò)程，一方面對(duì)第二濾液進(jìn)行濃縮，另一方面起初步純化的作用，除去小分子雜質(zhì)。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，吸附層析柱脫色包括：將所述濃縮液上柱，平衡1h后先后進(jìn)行洗滌脫色以及洗脫肝素鈉。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，洗滌脫色包括：用2bv溫度為40-50℃的蒸餾水洗滌，流速為2bv/h。本發(fā)明較佳的實(shí)施例中，洗脫肝素鈉包括：用2bv溫度為40-50℃、濃度為0.5mol/l的nacl溶液洗脫，流速為0.5bv/h。吸附層析柱脫色是對(duì)肝素鈉的二次純化，其主要目的是除去色素。吸附層析柱的填料為d208大孔吸附樹(shù)脂，該樹(shù)脂能有效地分離肝素鈉與色素，降低產(chǎn)品的光吸收率。該方案中，先用蒸餾水對(duì)吸附柱進(jìn)行洗滌，洗脫下色素，將蒸餾水加熱至40-50℃能有效提高色素的洗脫率，然后用溫度為40-50℃、濃度為0.5mol/l的nacl溶液洗脫肝素鈉，得到高純度的肝素鈉。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：(1)粗品肝素鈉經(jīng)過(guò)兩次蛋白酶解，將肝素鈉從蛋白質(zhì)復(fù)合物中充分游離出來(lái)，避免蛋白質(zhì)殘留影響其活性。(2)酶解液用鈣離子試劑絮凝沉淀蛋白質(zhì)以將其除去，避免使用乙醇多次分級(jí)沉淀，提高產(chǎn)品收率、降低物料浪費(fèi)。(3)肝素鈉分別經(jīng)過(guò)超濾濃縮初步純化、吸附層析柱脫色共兩次純化，得到的產(chǎn)品純度高，并且避免了使用氧化脫色，從而避免了引入異物以及及肝素鈉失活，從而提高肝素鈉的活性。具體實(shí)施方式本說(shuō)明書中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。本說(shuō)明書(包括任何附加權(quán)利要求、摘要)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。實(shí)施例1本實(shí)施例提供一種肝素鈉的制備方法，其包括：1.粗品溶解：稱取粗品肝素鈉100kg置于不銹鋼桶內(nèi)，加入500l2％(m/v)的nacl溶液，加熱至30℃，保溫浸泡6h使粗品肝素鈉充分溶解得到粗溶液并真空抽入酶解罐。2.兩次酶解：在酶解罐中，將粗溶液調(diào)節(jié)ph至7.5，并升溫至45℃，加入蛋白酶i2.5kg，保持溶液ph為7.5、溫度為45℃條件下攪拌并保溫6h得到第一酶解液。調(diào)節(jié)第一酶解液的ph至8.5，升溫至55℃，加入0.5％蛋白酶ⅱ2.5kg，保持溶液ph為8.5、溫度為55-℃條件下攪拌并保溫6h，然后調(diào)節(jié)ph至6.5并升溫至85℃，保溫0.5h，得酶解液。3.鈣離子絮凝沉淀：將酶解液冷卻至60℃以下，加入5kg(1-3％)氯化鈣，攪拌均勻后靜置沉淀2h；過(guò)濾去濾液得到第一濾液。4.去除多余鈣離子：用naoh調(diào)節(jié)第一濾液ph至11-12，攪拌后靜置1h，過(guò)濾得到第二濾液。5.超濾濃縮：將第二濾液的ph調(diào)節(jié)至7.5，攪拌后靜置0.5h，然后用分子截留量為5000的超濾膜濃縮至原體積的1/8得到凝縮液。6.d208吸附層析柱脫色：用輸液泵將濃縮液輸入吸附層析柱，上柱速度為1.0bv/h，上柱完成后平衡1h，用2bv溫度為40℃的蒸餾水洗滌脫色，流速為2bv/h。脫色完成后，用2bv溫度為40℃、濃度為0.5mol/l的nacl溶液洗脫得到肝素鈉溶液，流速為0.5bv/h。7.濃配及微孔過(guò)濾：向上述肝素鈉溶液中加入0.7倍體積的95％乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀2h后抽濾去沉淀，將沉淀用蒸餾水溶解成15％的濃度，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾后取濾液。8.凍干及粉碎：將上述濾液置于凍干機(jī)內(nèi)凍干，粉碎并過(guò)60目篩得到精品肝素鈉。實(shí)施例2本實(shí)施例提供一種肝素鈉的制備方法，其包括：1.粗品溶解：稱取粗品肝素鈉100kg置于不銹鋼桶內(nèi)，加入500l2％(m/v)的nacl溶液，加熱至38℃，保溫浸泡5h使粗品肝素鈉充分溶解得到粗溶液并真空抽入酶解罐。2.兩次酶解：在酶解罐中，將粗溶液調(diào)節(jié)ph至8.0，并升溫至47℃，加入蛋白酶i2.5kg，保持溶液ph為8.0、溫度為47℃條件下攪拌并保溫5h得到第一酶解液。調(diào)節(jié)第一酶解液的ph至9.0，升溫至58℃，加入0.5％蛋白酶ⅱ2.5kg，保持溶液ph為9.0、溫度為58℃條件下攪拌并保溫5h，然后調(diào)節(jié)ph至6.8并升溫至88℃，保溫0.5h，得酶解液。3.鈣離子絮凝沉淀：將酶解液冷卻至60℃以下，加入10kg氯化鈣，攪拌均勻后靜置沉淀2h；過(guò)濾去濾液得到第一濾液。4.去除多余鈣離子：用naoh調(diào)節(jié)第一濾液ph至11.5，攪拌后靜置1h，過(guò)濾得到第二濾液。5.超濾濃縮：將第二濾液的ph調(diào)節(jié)至7.7，攪拌后靜置0.5h，然后用分子截留量為6500的超濾膜濃縮至原體積的1/7得到凝縮液。6.d208吸附層析柱脫色：用輸液泵將洗脫液輸入吸附層析柱，上柱速度為1.0bv/h，上柱完成后平衡1h，用2bv溫度為45℃的蒸餾水洗滌脫色，流速為2bv/h。脫色完成后，用2bv溫度為45℃、濃度為0.5mol/l的nacl溶液洗脫得到肝素鈉溶液，流速為0.5bv/h。7.濃配及微孔過(guò)濾：向上述肝素鈉溶液中加入0.7倍體積的95％乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀2h后抽濾去沉淀，將沉淀用蒸餾水溶解成15％的濃度，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾后取濾液。8.凍干及粉碎：將上述濾液置于凍干機(jī)內(nèi)凍干，粉碎并過(guò)60目篩得到精品肝素鈉。實(shí)施例3本實(shí)施例提供一種肝素鈉的制備方法，其包括：1.粗品溶解：稱取粗品肝素鈉100kg置于不銹鋼桶內(nèi)，加入500l2％(m/v)的nacl溶液，加熱至45℃，保溫浸泡4h使粗品肝素鈉充分溶解得到粗溶液并真空抽入酶解罐。2.兩次酶解：在酶解罐中，將粗溶液調(diào)節(jié)ph至8.5，并升溫至50℃，加入蛋白酶i2.5kg，保持溶液ph為8.5、溫度為50℃條件下攪拌并保溫4h得到第一酶解液。調(diào)節(jié)第一酶解液的ph至9.5，升溫至60℃，加入0.5％蛋白酶ⅱ2.5kg，保持溶液ph為9.5、溫度為60℃條件下攪拌并保溫4h，然后調(diào)節(jié)ph至7.0并升溫至90℃，保溫0.5h，得酶解液。3.鈣離子絮凝沉淀：將酶解液冷卻至60℃以下，加入15kg氯化鈣，攪拌均勻后靜置沉淀2h；過(guò)濾取去濾液得到第一濾液。4.去除多余鈣離子：用naoh調(diào)節(jié)第一濾液ph至12，攪拌后靜置1h，過(guò)濾得到第二濾液。5.超濾濃縮：將第二濾液的ph調(diào)節(jié)至8.0，攪拌后靜置0.5h，然后用分子截留量為8000的超濾膜濃縮至原體積的1/5得到凝縮液。6.d208吸附層析柱脫色：用輸液泵將濃縮液輸入吸附層析柱，上柱速度為1.0bv/h，上柱完成后平衡1h，用2bv溫度為50℃的蒸餾水洗滌脫色，流速為2bv/h。脫色完成后，用2bv溫度為50℃、濃度為0.5mol/l的nacl溶液洗脫得到肝素鈉溶液，流速為0.5bv/h。7.濃配及微孔過(guò)濾：向上述肝素鈉溶液中加入0.7倍體積的95％乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀2h后抽濾去沉淀，將沉淀用蒸餾水溶解成15％的濃度，用0.45um微孔濾膜過(guò)濾后取濾液。8.凍干及粉碎：將上述濾液置于凍干機(jī)內(nèi)凍干，粉碎并過(guò)60目篩得到精品肝素鈉。實(shí)施例4本實(shí)施例提供了按照實(shí)施例1-3中的制備方法制備的精品肝素鈉的理化性質(zhì)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法：1.成品收率檢查實(shí)驗(yàn)方法：將按照3種制備方法得到的精品肝素鈉干燥后稱重，按照下式計(jì)算收率：收率(％)＝(精品重量/粗品重量)×100％成品收率結(jié)果如表1所示。2.吸附層析柱脫色工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法：取按照3種肝素鈉的制備方法制備的精品肝素鈉，加水制成4mg/ml的溶液，分別測(cè)定在260nm、280nm、400nm、420nm、470nm波長(zhǎng)處的吸光度均，測(cè)定結(jié)果如表2所示。表1肝素鈉的制備方法的收率驗(yàn)證結(jié)果組別理論收率范圍精品產(chǎn)量(kg)實(shí)際收率實(shí)施例160％-80％64.164.1％實(shí)施例260％-80％73.673.6％實(shí)施例360％-80％72.772.7％由表1可知，按照實(shí)施例1-3中提供的肝素鈉的制備方法得到的成品的收率符合理論收率范圍，由此說(shuō)明，本發(fā)明提供的肝素鈉的制備方法工藝可行。表2吸附層析柱脫色工藝驗(yàn)證結(jié)果表由表2可知，按照實(shí)施例1-3中提供的肝素鈉的制備方法得到的成品在個(gè)波長(zhǎng)出的光吸收綠均符合標(biāo)準(zhǔn)，由此說(shuō)明本發(fā)明提供的肝素鈉的制備方法中的吸附層析柱脫色工藝具有良好的脫色效果。本發(fā)明并不局限于前述的具體實(shí)施方式。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說(shuō)明書中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過(guò)程的步驟或任何新的組合。當(dāng)前第1頁(yè)12