本發(fā)明涉及肝素提取領(lǐng)域，具體而言，涉及一種提高肝素鈉提取得率的方法。
背景技術(shù)：
：肝素是一種由動(dòng)物解讀組織的肥大細(xì)胞所產(chǎn)生的酸性粘多糖額硫酸酯類(lèi)物質(zhì)，因其具有強(qiáng)抗凝作用，是放置深層靜脈血栓形成等血酸栓塞性疾病的首選藥物，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)肝素不僅有抗凝、抗血栓形成和調(diào)整血脂的作用，還有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能。雖然將肝素類(lèi)產(chǎn)品用于臨床已有60余年的歷史，但迄今還沒(méi)有一種能夠完全替代它的產(chǎn)品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化藥物，且目前只能從動(dòng)物的部分組織中提取，仍然不能人工合成。我國(guó)是生豬飼養(yǎng)、屠宰和消費(fèi)大國(guó)，更是腸衣加工大國(guó)。腸粘膜是提取肝素的最佳原料之一，我國(guó)也有大量致力于從腸黏膜中提取肝素產(chǎn)品的廠家。然而，我國(guó)現(xiàn)行的肝素提取和純化工藝比較落后，產(chǎn)品雜質(zhì)含量較高。為了滿足醫(yī)學(xué)臨床及生化研究，每年要從國(guó)外大量進(jìn)口精品肝素及低分子肝素。最早的肝素提取方法介紹見(jiàn)于howell在美國(guó)生理雜志上發(fā)表的文章，肝素提取需要去除雜質(zhì)后再精制，因此在處理原料時(shí)要通過(guò)酶水解、鹽析等方法去除蛋白質(zhì)，得到肝素粗品。粗品肝素中含有其它黏多糖，也含有一些殘余的蛋白質(zhì)和核酸類(lèi)物質(zhì)，從而使粗品肝素的效價(jià)過(guò)低。現(xiàn)有的工藝中，對(duì)酸堿性雜質(zhì)是通過(guò)等電點(diǎn)沉淀及熱變性作用、鹽析作用等辦法去除；對(duì)低抗凝活性的水溶雜質(zhì)，是通過(guò)控制產(chǎn)品溶液濃度特別是酒精沉淀濃度來(lái)加以去除；對(duì)熱原雜質(zhì)，通過(guò)超濾氧化及離子交換方法加以去除。國(guó)內(nèi)常用的豬小腸肝素提取方法是鹽析法；60、70年代美國(guó)專利技術(shù)-氧化法純化技術(shù)在國(guó)外曾經(jīng)廣泛采用；國(guó)內(nèi)90年代以前基本采用組合氧化法純化技術(shù)是肝素的主要純化方法，因此對(duì)氧化法純化技術(shù)研究的比較多。例如，現(xiàn)有技術(shù)(cn102746421a)公開(kāi)了一種粗品肝素鈉提純的方法，主要時(shí)對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行溶解、吸附、洗脫、沉淀和干燥處理，最終得到肝素鈉產(chǎn)品。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)(cn103588902a)公開(kāi)了一種采用吸附、醇沉以及兩步氧化法對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行提純的方法。同樣的，現(xiàn)有技術(shù)(cn10299336a)公開(kāi)了一種采用加入硅藻土、聚合氯化鋁后經(jīng)離心除雜，再經(jīng)醇沉、雙氧水氧化、醇沉以及過(guò)濾、冷凍干燥后得到肝素鈉產(chǎn)品。然而，這些傳統(tǒng)方法工藝較為復(fù)雜，產(chǎn)品的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，并且在提純過(guò)程中需要加入化學(xué)試劑，處理成本較高，精制的過(guò)程也較為復(fù)雜，產(chǎn)品純度也難以保證。近幾年，隨著生物技術(shù)的進(jìn)展，以及新型高分子材料的不斷出現(xiàn)，又有新成果出現(xiàn)。酶解輔助提取肝素，離子交換層析分離肝素技術(shù)是現(xiàn)在企業(yè)主要使用的技術(shù)。加入蛋白水解酶，可以減少水解時(shí)間和減少微生物的污染。但酶解技術(shù)受限于溫度、ph的控制，提取肝素后還要滅酶、并將其除去，同時(shí)采用離子交換法從酶解液中吸附肝素時(shí)，由于吸附不完全，所以會(huì)導(dǎo)致殘留液中仍含有較高量的肝素，從而影響肝素得率。進(jìn)一步的，由于吸附洗脫等條件未得到有效的調(diào)整和優(yōu)化，也進(jìn)一步影響了肝素的有效分離和獲得，影響了肝素的得率。雖然肝素提取純化技術(shù)的研究已有眾多報(bào)道，專家們?cè)诟鞣N提取、分離純化肝素的技術(shù)研究方面也做了大量工作，但綜合而言，提取技術(shù)水平較高的仍然是發(fā)達(dá)國(guó)家，他們不僅開(kāi)創(chuàng)和掌握了扎實(shí)的提取技術(shù)，并具有專用的高分子材料和裝備。國(guó)內(nèi)目前這方面欠缺的是先進(jìn)的工藝和配套的裝備。為此，進(jìn)一步深入探索粗肝素的酶解、提取和分離純化技術(shù)，選擇適合我國(guó)中小企業(yè)的粗品肝素生產(chǎn)模式及研究適合的技術(shù)裝備，將具有重要的實(shí)用價(jià)值。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種提高肝素鈉提取得率的方法，本發(fā)明方法中，通過(guò)采用復(fù)合酶對(duì)原料進(jìn)行酶解處理，并對(duì)吸附后解離條件的調(diào)整和優(yōu)化，從而不僅提高了肝素鈉的提取效率，同時(shí)也提高了肝素鈉粗品的得率。本發(fā)明的第二目的在于提供一種肝素鈉的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種提高肝素鈉提取得率的方法，所述方法包括如下步驟：將新鮮豬小腸處理后以復(fù)合酶進(jìn)行酶解，所得酶解液濃縮過(guò)濾后加入樹(shù)脂進(jìn)行吸附；吸附后的樹(shù)脂以濃度為0.3～0.6mol/l的鹽溶液進(jìn)行洗脫，洗脫液醇沉后，將所得固形物干燥，得到肝素鈉粗品；優(yōu)選的，鹽溶液的濃度為0.4～0.5mol/l。可選的，本發(fā)明中，所述將新鮮豬小腸處理包括如下步驟：將新鮮豬小腸放入刮腸機(jī)中，得到豬小腸粘膜，然后將其粉碎，加水?dāng)嚢琛？蛇x的，本發(fā)明中，所述復(fù)合酶包括堿性蛋白酶和胰蛋白酶。可選的，本發(fā)明中，所述復(fù)合酶的總量為0.3～0.5g/l。可選的，本發(fā)明中，所述樹(shù)脂為大孔樹(shù)脂；優(yōu)選的，所述樹(shù)脂為d208樹(shù)脂。可選的，本發(fā)明中，所述方法還進(jìn)一步包括在加入樹(shù)脂吸附前對(duì)體系ph進(jìn)行調(diào)整的步驟；優(yōu)選的，是將體系ph調(diào)整至7.5～8.5。可選的，本發(fā)明中，所述吸附的溫度為35～55℃；優(yōu)選的，所述吸附的溫度為40～50℃。可選的，本發(fā)明中，所述吸附的時(shí)間為3～6h；優(yōu)選的，所述吸附的時(shí)間為4～5h。可選的，本發(fā)明中，所述鹽溶液為氯化鈉或氯化鉀溶液；優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；更優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種肝素鈉的制備方法，所述方法包括如下步驟：首先按照本發(fā)明所述方法提取得到肝素鈉粗品，再由肝素鈉粗品精制得到肝素鈉。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)本發(fā)明方法中，以復(fù)合酶進(jìn)行酶解，從而能夠有效提高酶解處理的效率，而這也有利于提高肝素鈉粗品的得率；(2)本發(fā)明方法中，通過(guò)對(duì)吸附以及洗脫等步驟條件的選擇和調(diào)整，從而進(jìn)一步提高對(duì)肝素鈉產(chǎn)品的吸附和洗脫率，從而能夠進(jìn)一步提高肝素鈉粗品的收率。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。鑒于目前現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)肝素提取所存在的肝素得率低等問(wèn)題，本發(fā)明特采用一種復(fù)合酶酶解提取-提取液濃縮-過(guò)濾-樹(shù)脂吸附-洗脫-沉淀-干燥的方法進(jìn)行肝素提取，通過(guò)采用復(fù)合酶酶解以及對(duì)吸附、洗脫步驟的調(diào)整，從而有效提高了肝素的酶解處理和分離效率，進(jìn)而提高了肝素粗品的得率，具體的：本發(fā)明中，將原料新鮮豬小腸放入刮腸機(jī)中處理后，得到豬小腸粘膜，然后，將豬小腸粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁玫酱幚淼幕旌象w系；然后，對(duì)混合體系的溫度以及ph進(jìn)行調(diào)節(jié)，并將體系調(diào)整至適于酶解處理的條件；優(yōu)選的，可以將體系的ph調(diào)節(jié)至8.5～9，溫度調(diào)節(jié)至55～65℃；在調(diào)整完成后，向體系內(nèi)加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解；優(yōu)選的，所用到的復(fù)合酶為包含堿性蛋白酶和胰蛋白酶的復(fù)合酶，更優(yōu)選的，堿性蛋白酶和胰蛋白酶的質(zhì)量比為(2～4)：(1～2)；進(jìn)一步優(yōu)選的，在加入復(fù)合酶后，要使得體系中酶的總濃度能夠達(dá)到0.3～0.5g/l；酶解反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選的控制在2～4h，然后，將所得酶解液濃縮，并在濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，優(yōu)選的，所述大孔樹(shù)脂為d208樹(shù)脂；進(jìn)一步優(yōu)選的，在使用之前需要對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的步驟可參考如下：將原料干樹(shù)脂在蒸餾水中充分浸泡，然后在溶脹后濾干，加等體積乙醇攪拌1h,用蒸餾水洗凈濾干,加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,用蒸餾水洗至中性,濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2h,蒸餾水洗至中性,濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,水洗至中性,濾干后備用；加入大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附的步驟可優(yōu)選的參考如下：將濃縮過(guò)濾后所得濾液加入吸附罐中，然后加入離子交換水，并調(diào)整其鹽濃度為1～6mol/l，同時(shí)，優(yōu)選的將體系的ph調(diào)節(jié)至7.5～8.5，體系的溫度調(diào)節(jié)為35～55℃，體系溫度更優(yōu)選的調(diào)整至40～50℃；然后加入樹(shù)脂進(jìn)行離子交換，并吸附肝素鈉；吸附處理的時(shí)間優(yōu)選的控制在3～6h，更優(yōu)選的，吸附的時(shí)間控制在4～5h；然后，將離子交換后的樹(shù)脂以清水清洗后，進(jìn)行洗脫；洗脫的步驟可以參考如下：將吸附后的樹(shù)脂以鹽水洗脫，優(yōu)選的，所用鹽水為氯化鈉或氯化鉀溶液，更優(yōu)選的，所述鹽溶液為氯化鈉溶液；進(jìn)一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.3～0.6mol/l；更進(jìn)一步優(yōu)選的，所述氯化鈉溶液的濃度為0.4～0.5mol/l；然后將所得洗脫液以酒精沉淀，沉淀的時(shí)間控制在10～12h；然后，將體系進(jìn)行固液分離，將固形物在80～85℃條件下干燥10～15h后，即得到肝素鈉粗品。進(jìn)一步的，還可以以本發(fā)明肝素鈉粗品為原料，并進(jìn)一步精制得到高純度的肝素鈉，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)品的價(jià)值。實(shí)施例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例1的肝素鈉粗品。進(jìn)一步的，還可以將實(shí)施例1的肝素鈉粗品進(jìn)一步進(jìn)行純化，并得到高純度的肝素鈉產(chǎn)品。實(shí)施例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為35℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例2的肝素鈉粗品。實(shí)施例3新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為55℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例3的肝素鈉粗品。實(shí)施例4新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂，調(diào)節(jié)體系的ph至7.5，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例4的肝素鈉粗品。實(shí)施例5新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂，調(diào)節(jié)體系的ph至8.5，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例5的肝素鈉粗品。實(shí)施例6新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂，,調(diào)節(jié)體系ph至8.2進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.35mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例6的肝素鈉粗品。實(shí)施例7新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，按照2:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.55mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例7的肝素鈉粗品。對(duì)比例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，加入堿性蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對(duì)比例1的肝素鈉粗品。對(duì)比例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁蝗缓螅瑢Ⅲw系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至60℃，然后，加入胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹(shù)脂,調(diào)節(jié)體系ph至8.2，進(jìn)行吸附，吸附過(guò)程中，保持體系的溫度為45℃；在吸附4.5h后，將樹(shù)脂過(guò)濾得到，并以濃度為0.45mol/l的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對(duì)比例2的肝素鈉粗品。實(shí)驗(yàn)例1按照肝素鈉得率＝肝素鈉粗品質(zhì)量/新鮮粘膜質(zhì)量，分別計(jì)算各組實(shí)施例和對(duì)比例的肝素鈉得率，結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組肝素鈉得率(×100％)實(shí)施例10.035實(shí)施例20.029實(shí)施例30.030實(shí)施例40.027實(shí)施例50.026實(shí)施例60.024實(shí)施例70.022對(duì)比例10.015對(duì)比例20.013由如上的對(duì)比數(shù)據(jù)可以看出，以復(fù)合酶進(jìn)行酶解能夠有效提高肝素鈉粗品的得率；同時(shí)，由各實(shí)施例組的得率數(shù)據(jù)對(duì)比也可以看出，樹(shù)脂吸附和洗脫條件對(duì)于肝素鈉粗品的得率也有著一定的影響。然后，分別對(duì)各組所制得的肝素鈉粗品進(jìn)行吸光度測(cè)試，結(jié)果顯示：實(shí)施例1的肝素鈉粗品的吸光度明顯低于對(duì)比例1、2的吸光度。由此可見(jiàn)，以復(fù)合酶進(jìn)行酶解所得肝素鈉粗品的純度要優(yōu)于采用單一酶進(jìn)行酶解的產(chǎn)物；同時(shí)，實(shí)施例2-7所得肝素鈉粗品的吸光度基本相當(dāng)，且稍高于實(shí)施例1產(chǎn)品。由此可見(jiàn)，相較于其他實(shí)驗(yàn)組而言，以實(shí)施例1條件進(jìn)行樹(shù)脂吸附和鹽水洗脫所得肝素鈉的純度最高。盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁(yè)12