本發(fā)明涉及熒光探針，具體是一種萘基雙光子熒光探針及其制備方法，以及該探針在細(xì)胞線粒體中半胱氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

半胱氨酸(cys)作為人體必需的氨基酸和重要的生物硫醇，在許多細(xì)胞的生理活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后的修飾、解毒及其新陳代謝等過程。體內(nèi)半胱氨酸不足會(huì)導(dǎo)致幼兒發(fā)育不良、頭發(fā)脫色、水腫、肌無力、肥胖、肝臟損傷以及皮膚松弛等癥狀；而半胱氨酸濃度過高也與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，包括心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等。因此，針對(duì)生物樣品中半胱氨酸的高靈敏、實(shí)時(shí)檢測(cè)的研究已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。線粒體是真核細(xì)胞中一類非常重要的細(xì)胞器，是由兩層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，與人的疾病，衰老及細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系。為了更好地了解半胱氨酸在生物系統(tǒng)，尤其是線粒體中的作用，發(fā)展高敏感、高選擇性且線粒體靶向的半胱氨酸檢測(cè)方法仍舊是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。

目前文獻(xiàn)報(bào)道了許多基于半胱氨酸檢測(cè)的熒光探針，然而由于生物硫醇在結(jié)構(gòu)和生物活性上的相似性，能將半胱氨酸與高半胱氨酸(hcy)和谷胱甘肽(gsh)進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)的熒光探針十分有限，而且這類探針大多數(shù)不具有線粒體靶向性且為單光子熒光探針，通常局限于短波激發(fā)(400-560nm)，光損傷和光漂白較大，限制了在深組織成像中的應(yīng)用。相反，具有雙光子吸收性能的熒光探針結(jié)合雙光子熒光顯微成像技術(shù)(tpm)，則顯示出無可比擬的優(yōu)勢(shì)，如：雙光子激發(fā)波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)(700-900nm)，在實(shí)現(xiàn)深層透射的同時(shí)，避免了紫外光對(duì)生物組織的損傷及背景熒光的干擾，提高了空間分辨率，有利于三維成像；同時(shí)光漂白和光毒化較小，能夠?qū)ι飿悠愤M(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間觀察等。此外，具有比率發(fā)射特性的熒光探針能夠避免探針在細(xì)胞內(nèi)分布不均，環(huán)境因素以及儀器波動(dòng)等可能帶來的測(cè)定誤差，為準(zhǔn)確定量測(cè)定提供有效的工具。因此，迫切需要開發(fā)有效的比率發(fā)射型雙光子半胱氨酸熒光探針，并且能夠靶向定位于線粒體，實(shí)現(xiàn)對(duì)半胱氨酸的的高靈敏實(shí)時(shí)檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種萘基雙光子熒光探針及其制備方法，目的之二是提供該探針的用途，即利用雙光子成像技術(shù)在細(xì)胞線粒體內(nèi)半胱氨酸檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種萘基雙光子熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

該熒光探針選擇萘環(huán)為雙光子母體結(jié)構(gòu)，具有線粒體靶向定位功能的吡啶碘鹽為作為熒光團(tuán)，同時(shí)引入2,4-二硝基苯磺酰基作為半胱氨酸的識(shí)別基團(tuán)。利用巰基將2,4-二硝基苯磺酰基斷裂產(chǎn)生羥基，發(fā)生熒光光譜紅移，實(shí)現(xiàn)對(duì)半胱氨酸的比率檢測(cè)。該探針能夠?qū)Π腚装彼徇M(jìn)行靈敏、快速、高選擇性的響應(yīng)，并特異性靶向定位于線粒體，利用雙光子成像技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞中半胱氨酸的比率成像。

本發(fā)明提供的一種萘基雙光子熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)將1-甲基-4-[2-(6-羥基-2-萘)-乙烯基]-吡啶碘鹽和甲醇鈉按摩爾比1:1溶于甲醇中，60℃加熱反應(yīng)4小時(shí)，冷卻過濾得到藍(lán)色固體。

(2)將上述反應(yīng)得到的藍(lán)色固體，2,4-二硝基苯磺酸氯和三乙胺按摩爾比1:1.2:1加入到無水乙腈中，60℃加熱反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸餾得到粗品。

(3)粗品經(jīng)硅膠柱分離，得到純品。

其合成路線如下：

本發(fā)明的探針具有良好的細(xì)胞膜通透性，能夠特異性的靶向標(biāo)記線粒體，并能夠?qū)?xì)胞線粒體內(nèi)半胱氨酸的變化進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。

與現(xiàn)有的熒光探針相比，本發(fā)明萘基雙光子熒光探針具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本探針合成步驟簡(jiǎn)便，成本低廉，有利于商品化生產(chǎn)；(2)本探針選擇萘環(huán)為雙光子母體結(jié)構(gòu)，吡啶碘鹽為熒光團(tuán)且具有線粒體靶向定位功能，同時(shí)引入2,4-二硝基苯磺酰基作為cys的識(shí)別基團(tuán)。利用巰基將2,4-二硝基苯磺酰基斷裂產(chǎn)生羥基，發(fā)生熒光光譜紅移，實(shí)現(xiàn)對(duì)cys的比率檢測(cè)(f583nm/f485nm)；(3)對(duì)cys的檢測(cè)在2min內(nèi)達(dá)到最大值，該響應(yīng)時(shí)間比大部分文獻(xiàn)報(bào)道的生物硫醇探針都要短；(4)熒光強(qiáng)度的比值(f583nm/f485nm)與cys濃度在2.0-10μm范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，且檢測(cè)線低達(dá)29nm。(5)良好的選擇性，本探針與cys的反應(yīng)比與其他生物硫醇更有活性，應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)cys的選擇性檢測(cè)而不受其他物質(zhì)的干擾；(6)在自然光和紫外燈下溶液顏色變化明顯，可以通過肉眼觀察；(8)本探針能夠雙光子靶向標(biāo)記線粒體，同時(shí)能夠利用雙光子熒光成像技術(shù)高靈敏檢測(cè)線粒體內(nèi)cys的變化。

附圖說明

圖1.本發(fā)明探針的核磁表征，¹h-nmr和¹³cnmr譜。

圖2.本發(fā)明探針的質(zhì)譜表征，ms(lc-ms)譜。

圖3.本發(fā)明探針與cys(100μm)反應(yīng)隨時(shí)間變化的紫外-可見吸收光譜圖。

圖4.本發(fā)明探針在自然光下識(shí)別cys前后顏色變化，顏色由無色變?yōu)辄S色。

圖5.本發(fā)明探針與cys(100μm)反應(yīng)隨時(shí)間變化的熒光光譜圖。

圖6.本發(fā)明探針在紫外燈下識(shí)別cys前后顏色變化，顏色由淡藍(lán)色變?yōu)辄S色。

圖7.本發(fā)明探針探針對(duì)cys(0-300μm,即0-30eq)響應(yīng)的熒光光譜滴定圖。

圖8.本發(fā)明探針的熒光強(qiáng)度比值(f583nm/f485nm)與cys濃度在2.0-10μm范圍內(nèi)的線性關(guān)系圖。

圖9.本發(fā)明探針(10μm)與各種生物硫醇和na2s(100μm)，常見氨基酸和其它各種常見離子(500μm)反應(yīng)5min后，對(duì)cys的選擇性。

圖10.不同ph值對(duì)本發(fā)明探針與cys反應(yīng)的影響。

圖11.本發(fā)明探針與cys反應(yīng)后的質(zhì)譜圖。

圖12.本發(fā)明探針對(duì)cys的識(shí)別機(jī)理。

圖13.本發(fā)明探針與市售紅色線粒體探針(mitotrackerred)在ph值7.4的條件下共同孵育30min的雙光子共定位熒光成像圖。

圖14.本發(fā)明探針在細(xì)胞中cys經(jīng)硫醇封阻劑n-乙基馬來酰亞胺(nem)處理前后的雙光子成像圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

萘基雙光子熒光探針的合成路線：

合成步驟及表征：

在n2保護(hù)下，將1g(2.56mmol)1-甲基-4-[2-(6-羥基-2-萘)-乙烯基]-吡啶碘鹽和0.14g(2.56mmol)甲醇鈉加入到50ml無水甲醇中，60℃加熱反應(yīng)4小時(shí)，溶液顏色由黃色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，冷卻過濾得到藍(lán)色固體，未將處理直接進(jìn)行下一步反應(yīng)。將1g(2.43mmol)藍(lán)色固體，0.78g(2.92mmol)2,4-二硝基苯磺酸氯和0.26g(2.43mmol)三乙胺加入到100ml無水乙腈中，60℃加熱反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸餾得到粗品。粗產(chǎn)品經(jīng)柱色譜分離(二氯甲烷為流動(dòng)相)得到土黃色固體1.05g，產(chǎn)率84％。¹h-nmr(dmso-d6,600mhz，圖1)δ9.16(d,j＝2.0hz,1h),8.89(d,j＝6.5hz,1h),8.58(dd,2h),8.40(dd,j＝8.6,2.1hz,2h),8.34–8.23(m,2h),8.16(d,j＝16.2hz,1h),8.12–8.00(m,3h),7.86(s,1h),7.69(d,j＝16.4hz,1h),7.40(d,j＝8.8hz,1h),4.27(s,3h)ppm.¹³cnmr(151mhz,dmso，圖1)δ152.05(s),151.47(s),148.06(s),147.30(s),146.86(s),145.15(s),144.63(s),139.80(s),133.74(s),133.50(s),131.80(s),131.33(s),130.64(s),129.19(s),128.90(s),127.42(s),125.54(s),124.95(s),124.49(s),123.60(s),121.05(s),119.77(s),118.22(s),46.90(s)ppm.ms(lc-ms，圖2)m/zcalcdforc24h18n3o7s⁺,492.0860,measured,492.0857.

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中的探針用dmso配制濃度為1mm的儲(chǔ)備液。將cys溶于二次水配成0.1m的溶液備用。實(shí)驗(yàn)中用dmso/pbs緩沖液(ph7.4)體系(v/v＝1/1)將探針稀釋至終濃度10μm，記錄探針與cys(100μm)反應(yīng)隨時(shí)間變化的紫外-可見吸收光譜(圖3)。隨著探針與半胱氨酸反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，352nm處的最大吸收峰逐漸減小并紅移到392nm處，在370nm處出現(xiàn)一個(gè)等吸收點(diǎn)，并且392nm處的吸收峰達(dá)到最大的時(shí)間為2min。同時(shí)溶液顏色由無色變?yōu)辄S色(圖4)。

實(shí)施例3

用dmso/pbs緩沖液(ph7.4)體系(v/v＝1/1)將探針稀釋到10μm，記錄探針與cys(100μm)反應(yīng)隨時(shí)間變化的熒光光譜光譜，固定激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為2.0nm。如圖5所示，未加cys之前，探針的最大熒光發(fā)射位于485nm處，隨著探針與半胱氨酸反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，485nm處的熒光發(fā)射逐漸降低，在583nm處出現(xiàn)一個(gè)新的熒光發(fā)射并顯著增強(qiáng)，同時(shí)在502nm處出現(xiàn)一個(gè)清晰的等電點(diǎn)。并且該反應(yīng)在2min達(dá)到最大值，這個(gè)反應(yīng)速度比大部分文獻(xiàn)報(bào)道的生物硫醇探針都要快。在紫外燈照射下，溶液的顏色由淺藍(lán)色變?yōu)榫G色(圖6)。

實(shí)施例4

用dmso/pbs緩沖液(ph7.4)體系(v/v＝1/1)將探針稀釋到10μm，記錄探針對(duì)cys(0-300μm,即0-30eq)響應(yīng)的熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)，固定激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬帶均為2.0nm。如圖7所示，隨著cys濃度的增大，探針呈現(xiàn)顯著的比率熒光發(fā)射特性(f583nm/f485nm)，并且當(dāng)cys濃度增大到10μm(即1eq)時(shí)，探針在583nm出的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。此外，熒光強(qiáng)度的比值(f583nm/f485nm)與cys濃度在2.0-10μm范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖8)。線性回歸方程為f583nm/f485nm＝1.591ccys-2.766，線性相關(guān)系數(shù)為0.992，并且檢測(cè)線低達(dá)29nm。

實(shí)施例5

考察實(shí)施例1中的探針(10μm)與各種生物硫醇和na2s(100μm)，常見氨基酸和其它各種常見離子(500μm)反應(yīng)5min后，對(duì)cys的選擇性。由圖9可知，探針與cys反應(yīng)后f583nm/f485nm增加超過14倍，而hcy，gsh和na2s的比率熒光(f583nm/f485nm)小于3.7倍，未對(duì)cys的檢測(cè)形成明顯干擾，此外，其他物質(zhì)的比率熒光(f583nm/f485nm)均未發(fā)生明顯的改變。該結(jié)果證明探針與cys的反應(yīng)比與其他生物硫醇更有活性，并且可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)cys的選擇性檢測(cè)而不受其他物質(zhì)的干擾。圖9中各物質(zhì)的順序和濃度依次為：(1)blank；(2)cys；(3)hcy；(4)gsh；(5)na2s；(6)asp；(7)val；(8)phe；(9)tyr；(10)ala；(11)ser；(12)leu；(13)arg；(14)pro；(15)thr；(16)glu；(17)；try；(18)iso；(19)lys；(20)gly；(21)k⁺；(22)na⁺；(23)ca²⁺；(24)mg²⁺；(25)al³⁺；(26)zn²⁺；(27)cl^-；(28)cu²⁺；(29)fe³⁺；(30)br^-；(31)so3^2-；(32)so4^2-；(33)co3^2-；(34)aco；(35)no3^-；(36)no2^-.

實(shí)施例6

考察不同ph值對(duì)實(shí)施例1中的探針(10μm)及其與cys(10μm)反應(yīng)的影響。如圖10所示，在ph值3-9范圍內(nèi)，其改變對(duì)探針本身的f583nm/f485nm值沒有任何影響，說明探針對(duì)ph值的穩(wěn)定性；當(dāng)探針中加入cys后，在ph值小于5時(shí)f583nm/f485nm值沒有明顯的改變，大于5后f583nm/f485nm值迅速增加并在生理ph值7.4附近達(dá)到最大值。結(jié)果表明，探針可以在較大的ph值范圍內(nèi)穩(wěn)定存在，并且在ph7.4附近對(duì)cys的響應(yīng)能力最佳，適宜于生物體系的應(yīng)用。

實(shí)施例7

利用質(zhì)譜考察探針和cys的反應(yīng)產(chǎn)物。如圖2所示，探針本身主要觀察到m/z為492.0857的峰。當(dāng)探針與cys反應(yīng)后，主要觀察到質(zhì)譜峰m/z值為288.0287(圖11)和262.1222(圖11)，分別與化合物1和2的質(zhì)譜峰一致。該結(jié)果證實(shí)，探針對(duì)cys的識(shí)別機(jī)理如圖12所示。半胱氨酸的巰基可將磺酰酯基斷裂產(chǎn)生羥基得到化合物1，同時(shí)產(chǎn)生化合物2并脫去so2分子。

實(shí)施例8

將實(shí)施例1中的探針、市售紅色線粒體探針(mitotrackerred)與hela細(xì)胞在ph值7.4條件于37℃、5％co2的孵育箱中共同孵育30min，分別在雙光子和單光子顯微鏡下觀察熒光成像。固定激發(fā)波長(zhǎng)分別為760nm和580nm，發(fā)射波段分別收集黃色通道(510-610nm)和黃色通道(620-660nm)。如圖13所示，探針的雙光子綠色熒光(圖13a，假色成像)和mitotrackerred的單光子紅色熒光(圖13b)能夠很好的重疊(圖13c)。此外，二者在細(xì)胞內(nèi)的熒光光譜變化趨向一致(圖13e)，且共定位率高達(dá)0.94(圖13f)，說明探針能有效地靶向線粒體。

實(shí)施例9

將實(shí)施例1合成的探針與hela細(xì)胞在ph值7.4條件于37℃、5％co2的孵育箱中孵育30min，固定激發(fā)波長(zhǎng)分別為760nm，發(fā)射波段分別收集藍(lán)色通道(400-500nm)和黃色通道(510-610nm)。在雙光子顯微鏡下探針觀察到非常弱的藍(lán)色熒光(圖14a，藍(lán)色通道)和明亮的黃色熒光(圖14b，黃色通道)，這是由于細(xì)胞中存在內(nèi)生的cys。其次，將細(xì)胞用n-乙基馬來酰亞胺(nem，1.0mm)預(yù)處理(硫醇封阻劑，能夠屏蔽細(xì)胞內(nèi)硫醇類物質(zhì))30min，然后與探針(10μm)共孵育30min，這時(shí)，藍(lán)色通道的藍(lán)色雙光子熒光增強(qiáng)(圖14d)，而黃色通道中的黃色熒光發(fā)射減弱(圖14e)，表明硫醇類物質(zhì)被nem完全屏蔽。最后，將nem預(yù)處理過的hela細(xì)胞與cys(100μm)共孵育20min，然后加入探針(5μm)，可觀察加了cys的細(xì)胞的藍(lán)色熒光明顯減弱(圖14g，藍(lán)色通道)，同時(shí)黃色熒光急劇增強(qiáng)(圖14h，黃色通道)。該結(jié)果證實(shí)探針有能力作為比率型雙光子熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞線粒體內(nèi)cys的高靈敏檢測(cè)。