本發明屬于天然產物提純
技術領域：
，具體是一種高純度egcg的制備方法。
背景技術：
：茶多酚（teapolyenohs）主要由兒茶素、黃酮、酚酸、花色素4大類物質組成。而兒茶素（catechins）占茶多酚總量的60%～80%。現代研究表明，兒茶素既是理想的天然抗氧化劑，又是一類極有價值的天然藥物原料，它具有抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抑菌、抗艾滋病病毒等功效。茶多酚中兒茶素類單體化合物主要有表兒茶素（ec）、表沒食子兒茶素（egc）、表兒茶素沒食子酸酯（ecg）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gcg）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（egcg）等，其中最具生物活性的是egcg。近年來，世界發達國家積極推進兒茶素產品的開發應用，以其作為天然抗氧化劑和自由基清除劑，已廣泛應用于食品加工、醫藥保健和日用化工等領域，尤其是fda確認兒茶素具有藥效功能后，國際市場對其需求量日增。研究各種兒茶素的藥理活性和協同作用以及其在體內的代謝情況，開發兒茶素類新藥，均需大量高純度的各類兒茶素單體。尤其是酯型兒茶素egcg，其功效遠遠大于其他兒茶素組分，成為兒茶素分離純化與臨床應用研究的焦點。egcg純品為白色粉末，味苦澀、無毒、極易溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯，不溶于氯仿，在空氣中易被氧化，變成微粉色，也容易隨著溫度的升高而被氧化。egcg的提純制備，主要是采用色譜法或色譜聯用的方法。其中高效液相色譜法（hplc）操作簡便易行，分離效果好，如果選擇合適的柱操作條件，兒茶素粗品可以不經過預處理就能得到較好的分離。但該法成本較高，且分離量小，難以進行工業化生產。高速逆流色譜法（hsccc）盡管較hplc法增大了制備量，但仍難滿足工業化生產的要求。臨界流體萃取法（sfe）用于制備egcg。該方法無污染，分離量大，利于工業化。但是由于茶多酚在超臨界co2中溶解度較低，使得分離的產率很低。中國專利201410562697.1，200910273058.2公開了采用單柱色譜分離法來分離純化egcg，雖然單柱處理量大，但不能達到連續分離的目的，操作繁瑣。且所使用的分離樹脂均是反相硅膠c18，其價格昂貴，用乙醇洗脫死吸附大，樹脂報廢率高，不適用于工業化生產。此外，專利201410766716.2使用氫鍵型大孔吸附樹脂作為分離樹脂，其所選用的樹脂具有吸附率高，解吸率低或者吸附率低，解吸率高的特點，用來制備egcg樹脂容易中毒、產品得率低。專利201110171485.7使用二組分模擬移動床分離純化egcg,由于egcg為中間洗脫組分，前后均有其他組分的干擾，使用二組分模擬移動床必須分兩步進行分離，該專利所使用的模擬移動床為小試級別且使用的分離樹脂為反相硅膠c18，成本高，樹脂報廢率高，且所采用的濃縮方式為的旋轉蒸發，濃縮效率差，低溫不容易濃縮，長時間濃縮容易造成egcg氧化；高溫濃縮時間短，但egcg更容易被氧化。因此，該工藝不適用于工業化生產。此外，吸附樹脂均存在不同程度的死吸附，解吸率達不到100%，且經過兩次分離前后組分均會帶出部分egcg，因此，egcg的回收率較低。技術實現要素：本發明針對現有egcg分離制備存在的問題，提供一種以茶多酚為原料，基于三組分模擬移動床色譜分離技術，以非極性大孔吸附樹脂為分離載體，實現egcg的高效分離純化。本方法分離得到的egcg純度95%以上，得率80%以上，結晶后產品純度99%以上，回收率95%以上。為了實現以上目的，本發明采用的技術方案如下：一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）將茶多酚原料用乙醇溶解至干物質含量為5-35%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為10-40%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離提純，分離純化后的egcg通過低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。進一步地，以上步驟（1）所述的乙醇質量濃度為10%。進一步地，所述非極性大孔吸附樹脂型號包括hz-816、hz-818、hz-835、色譜3號和20ss中的一種。進一步地，步驟（2）所述的乙醇質量濃度為20-50%。進一步地，所述的三組分模擬移動床為10-25根色譜柱首尾順序相連，內部填充非極性大孔吸附樹脂，通過中央控制裝置控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，實現三組分的分離。進一步地，所述的中央控制裝置為計算機、plc程序控制泵、電磁閥、流量計。進一步地，所述三組分模擬移動床分離提純是在40-50℃柱溫條件下連續進料和出料。進一步地，所述低溫真空減壓濃縮時在溫度為20-40℃、壓力為-0.098mpa下減壓濃縮。與現有技術相比，本發明的有益效果為：1、本發明方法基于三組分模擬移動床分離技術，以價格低廉的非極性大孔吸附樹脂為分離載體，可以實現egcg和其他化合物的連續高效分離；分離得到的egcg純度95%以上，得率80%以上，結晶后產品純度99%以上，回收率95%以上。2、本發明使用的三組分模擬移動床，使得egcg含量由30-60%提高到95-99%，相比二組分模擬移動床具有能夠一次性實現egcg的連續有效分離，分離效率高，產品得率高，純度高的優點。3、本發明所使用的非極性大孔吸附樹脂，其吸附率、解吸率均在90%以上，樣品回收率高，且具有價格低廉、可反復使用的特點。4、本發明使用低溫真空減壓濃縮方式結晶，避免了egcg在濃縮過程中因高溫而被氧化，保證成品品質。5、本發明方法工藝簡單、無污染，雜質少，綠色環保、成本低廉、生產效率高、生產過程技術指標可控性強，容易實現工業化生產。附圖說明圖1是茶多酚原料經層析柱預處理后的各組分含量液相圖；圖2是三組分模擬移動床分離后前雜出口端各組分液相圖；圖3為三組分模擬移動床分離后egcg出口端各組分液相圖；圖4是三組分模擬移動床分離后后雜出口端各組分液相圖。具體實施方式下面將結合具體實施例對本發明進一步詳細說明，但不限于本發明的保護范圍。實施例1一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以以市售茶多酚（egcg含量為29.93%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為10%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為40%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由15根色譜柱首尾順序相連，以hz-818大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為95.58%（見圖3），得率為80.23%。分離純化后的egcg在溫度為25℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.32%，回收率為95.21%。圖1為本實施例茶多酚原料經層析柱預處理后的各組分含量液相圖，具體組分的含量見下表1數據，其中組分8為egcg，組分1-7為前雜組分；組分9-18為后雜組分。表1：茶多酚原料經層析柱預處理后的各組分含量序號保留時間峰高峰面積結果(%)11.811323320650.1422.86248691840760.8233.04606872275731.0243.292160186160.0853.93164373382671.5164.396264651750.2974.6865161015960.4585.39585074670919029.9396.2748954050.02106.591715287860.13117.147831411044984.93127.528493421051596448.21138.176565735680.33148.69523768199683.66159.6135760450.031610.171229172210.081710.947664715933067.111814.2456821924710.86圖2為三組分模擬移動床分離后前雜出口端各組分液相圖，具體組分的含量見下表2數據，組分8為egcg，組分1-7為前雜組分；組分9為后雜組分。表2：三組分模擬移動床分離后前雜出口端各組分含量序號保留時間峰高峰面積結果(%)12.467182300451.0122.884706034011711.4133.0612084743303014.5343.316892581601.9553.90112650154900651.9664.391728124180.4274.743403472051.5885.393484242715914.3396.134677837792.81圖3為三組分模擬移動床分離后egcg出口端各組分液相圖；具體組分見下表數據：組分5為egcg，組分1-4為前雜組分；組分6-7后雜組分。表3：三組分模擬移動床分離后egcg出口端各組分含量序號保留時間峰高峰面積結果(%)12.8999832390.0623.085994322330.5934.20151951150.0944.70174274280.1455.40479358523523695.5867.0485371050261.9277.824941890421.63圖4是三組分模擬移動床分離后后雜出口端各組分液相圖；具體組分見下表數據：組分1為egcg，組分2-5為后雜組分。表4：三組分模擬移動床分離后后雜出口端各組分含量序號保留時間峰高峰面積結果(%)15.41561416113346.0427.34781254881931987.1538.143479305740.3048.62217953368223.33510.88175123215923.18實施例2一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為54.12%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為10%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為40%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由15根色譜柱首尾順序相連，以hz-818大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為97.33%，得率為85.45%。分離純化后的egcg在溫度為30℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.52%，回收率為96.44%。實施例3一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為29.93%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為30%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填hz-816非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為30%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由10根色譜柱首尾順序相連，以hz-816大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為96.64%，得率為82.34%。分離純化后的egcg在溫度為30℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.48%，回收率為95.42%。實施例4一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為54.12%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為20%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填hz-835非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為20%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為40%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由20根色譜柱首尾順序相連，以hz-816大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在45℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為99.12%，得率為82.67%。分離純化后的egcg在溫度為25℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.97%，回收率為98.45%。實施例5一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為29.93%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為5%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜3號非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為20%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由25根色譜柱首尾順序相連，以hz-835大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在50℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為95.78%，得率為81.47%。分離純化后的egcg在溫度為40℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.42%，回收率為95.84%。實施例6一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為54.12%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為25%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜20ss非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為40%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為10%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由25根色譜柱首尾順序相連，以hz-835大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為98.62%，得率為80.69%。分離純化后的egcg在溫度為35℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.73%，回收率為97.89%。實施例7一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為29.93%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為35%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為20%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由20根色譜柱首尾順序相連，以色譜3號大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在50℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為95.28%，得率為80.36%。分離純化后的egcg在溫度為20℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.22%，回收率為95.45%。實施例8一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為54.12%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為25%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為25%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由25根色譜柱首尾順序相連，以色譜3號大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為96.55%，得率為80.18%。分離純化后的egcg在溫度為20℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.53%，回收率為97.76%。實施例9一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為29.93%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為20%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為20%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為30%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由20根色譜柱首尾順序相連，以20ss大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在50℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為95.44%，得率為81.26%。分離純化后的egcg在溫度為25℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.23%，回收率為95.44%。實施例10一種高純度egcg的制備方法，包括以下步驟：（1）以市售茶多酚（egcg含量為54.12%）為原料，用質量濃度為10%乙醇溶解至干物質含量為30%，得茶多酚溶液；（2）將茶多酚溶液通過裝填色譜hz-818非極性大孔吸附樹脂的層析柱，先用純水洗脫預處理后，再用濃度為30%的乙醇洗脫，收集洗脫液并濃縮至干物質含量為40%，得濃縮洗脫液；（3）將濃縮洗脫液通過三組分模擬移動床分離，由25根色譜柱首尾順序相連，以20ss大孔吸附樹脂為分離載體，通過中央控制裝置、計算機、plc程序控制流量泵、流量計、電磁閥的切換來選擇控制進洗脫劑端口、進料液端口、前雜出口端、egcg出口端和后雜出口端五個端口的流量，在40℃柱溫條件下連續分離，分離后得到的egcg純度為97.43%，得率為80.76%。分離純化后的egcg在溫度為40℃、壓力為-0.098mpa下低溫真空減壓濃縮的方式結晶，即得高純度egcg產品。結晶后產品純度為99.82%，回收率為96.94%。當前第1頁12