本發明屬于分離分析技術領域，具體涉及一種環烯醚萜苷假模板分子印跡聚合物及其制備方法與應用。

技術背景

現代化的中藥質量評價模式是確保中藥質量及其療效的關鍵所在。由于中藥多組分、多靶點的特點，單一指標性成分測定已不能適應建立現代化中藥質量評價模式的要求。以中國藥典為例，2010版藥典選用丹參酮ⅱa、鹽酸小檗堿、馬錢苷作為丹參、功勞木、山茱萸及其復方制劑(如六味地黃丸、杞菊地黃丸、知柏地黃丸和桂附地黃丸等)的指標成分，而2015版中國藥典則變更增選丹參酮ⅱa、隱丹參酮與丹參酮ⅰ總量作為丹參質量控制標準，增選非洲防己堿、藥根堿、巴馬汀和小檗堿總量作為功勞木指標成分，增選馬錢苷、莫諾苷作為山茱萸及其方劑質量控制標準。藥效組分群質量評價模式替代單組分質量評價模式已成為中藥質量評價方法的發展趨勢。

環烯醚萜苷類“藥效組分群”廣泛共存于玄參科、茜草科、唇形科、龍膽科、馬鞭草科等雙子葉植物中，具有抗腫瘤、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗病毒、降血糖、治療白血病、防治心腦血管疾病等多種生物活性，常作為梔子、龍膽、山茱萸等藥材及其復方制劑的質量控制指示性成分。環烯醚萜苷化學結構相近且基體復雜，如山茱萸復方制劑六味地黃丸中環烯醚萜苷類成分包括馬錢苷、莫諾苷、甲氧基莫諾苷、斷氧化馬錢苷、獐牙菜苷、山茱萸苷等。六味地黃丸由熟地黃、山茱英制、牡丹皮、山藥、獲答、澤瀉等六味中藥組合而成的，作為滋陰補腎的中藥，臨床效果甚佳。2015版中國藥典中選馬錢苷和莫諾苷總量作為六味地黃丸質量控制標準，并且在成方制劑和單味制劑中的六味地黃丸，要求每丸含酒萸肉以莫諾苷(c17h26o11)和馬錢苷(c17h26o10)的總量計，不得少于0.37mg。粗提液及混合對照品hplc色譜圖所示，中藥或方劑中相近保留時間化學成分的“峰重疊”制約了樣品中的色譜峰識別。復雜基質下藥效組分群的快速靶向富集已成為中藥質量評價的關鍵問題之一。加強高極性藥效組分群分離基礎研究，利于突破中藥復雜樣品物質分離瓶頸，為中藥質量評價模式的制定提供理論依據。

分子印跡技術能夠制備“預構化”的分子印跡聚合物(mips)，mips對于目標分子具有特異識別性。因mips材料極高的選擇性及卓越的分子識別性能，很快在固相萃取、手性拆分、生物傳感器等方面得到了廣泛的應用。分子印跡-固相萃取技術將mips用作固相萃取填料從樣品中純化、富集目標分子及其結構類似物，能夠克服分析過程中因基質復雜所帶來的內源性干擾難題，在中藥及其制劑質量控制方向展現出極大應用前景。分子印跡對于在天然產物中含量低、藥效高的成分的鑒定分析和分離純化提供了方法借鑒，但是其特異選擇性有待提高。

目前環烯醚萜苷分子印跡聚合物分別由專利201510861116.9、201610542765.7和201611121434.2制得。傳統環烯醚萜苷分子印跡聚合物均以京尼平苷等環烯醚萜苷為模板制備。該方法面臨著一些技術上的挑戰。首先，模板泄漏(templatebleeding)問題便是其中之一。由于在傳統的mip合成中使用大量目標分子作為模板分子，mip的網絡交聯度很高，模板分子完全去除比較困難，即使經過有機溶劑的反復洗脫，仍然會存在模板殘留的問題。這樣的mip作為填充材料應用于微痕量物質的分析檢測與提取時，模板分子會緩慢地釋放到樣品中，從而引起樣品污染，并降低分析的精確度和準確度。其次，模板分子環烯醚萜苷價格昂貴，制約了環烯醚萜苷分子印跡聚合物的大規模制備。

技術實現要素：

針對上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物的制備方法，以環烯醚萜苷類似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷為假模板，將假模板、功能單體、交聯劑、引發劑、制孔劑按照本體聚合的方法制得分子印跡聚合物。

本發明的第二個目的在于提供上述制備方法制備得到的假模板分子印跡聚合物。

本發明的第三個目的在于提供該假模版分子印跡聚合物在六味地黃丸中環烯醚萜苷的提取分離中的應用。

為了解決以上技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物的制備方法，包括以下步驟：

1)以環烯醚萜苷類似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷為假模板，將假模板、功能單體、交聯劑、引發劑和制孔劑加入反應釜中混合，超聲脫氣和充氮除氧后，恒溫聚合，得到帶有假模板分子的聚合物；

2)將步驟1)中制備的帶有假模板分子的聚合物研磨、清洗除去模板分子，得到留有分子印跡孔穴的分子印跡聚合物顆粒。

本發明在分子印跡聚合物合成過程中選用4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷作為模板，利用分子印跡技術為環烯醚萜苷量身定做識別材料，洗脫出模板，在材料上留有與環烯醚萜苷分子體積、結構、極性相匹配的孔穴(或稱為印跡)，模板洗脫時，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以被較為完全地洗脫，最大限度降低了模板的殘留，避免了對待測樣品的污染，可以提高分析的精確度和準確度。同時，與傳統模板分子環烯醚萜苷相比，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以采用化學方法合成，而且合成方法簡便可行，可以為大規模制備分子印跡聚合物提供可靠的原料來源，使制備成本大大降低。

采用該種方法制備的分子印跡聚合物用于提純環烯醚萜苷時，只有環烯醚萜苷分子能夠進入印跡當中，而其它的雜質分子不能進入印跡，使得該分子印跡聚合物主要吸附環烯醚萜苷，其它的雜質吸附的很少，使得環烯醚萜苷的純度大大提高，可達到95％以上。

進一步的，步驟1)中，所述功能單體為9-乙烯基蒽或n-乙烯基咔唑。

進一步的，步驟1)中，所述的交聯劑為n,n-二甲基二丙烯酰胺、二乙烯基苯。優選為n,n-二甲基二丙烯酰胺。

進一步的，所述制孔劑為二甲基亞砜或四氫呋喃；優選為四氫呋喃。

進一步的，所述引發劑為偶氮二異丁腈或偶氮二異戊腈；優選為偶氮二異丁腈。

進一步的，步驟1)中，假模板、功能單體、交聯劑、引發劑、制孔劑按質量比為1-3:2-6:15-30:0.05-0.10:20-70。采用該配比合成的分子印跡聚合物用于環烯醚萜苷的分離提取時，具有更好的選擇性，有利于提高檢測的準確性。

進一步的，步驟1)中，超聲脫氣的時間為10-15min，充氮除氧的時間為10-15min。

進一步的，步驟1)中，恒溫聚合的溫度為40-60℃，時間為18-24h。

進一步的，步驟2)中，將聚合物研磨后過150-200目篩，得到均勻的帶有模板分子的分子印跡聚合物顆粒。

進一步的，步驟2)中，采用體積分數為10％-20％的乙酸的甲醇溶液洗脫除去分子印跡聚合物中的模板分子。

試驗發現，采用體積分數為10％-20％的乙酸的甲醇溶液對帶有模板的分子印跡聚合物進行洗滌時，可以徹底除去聚合物中的模板分子，最大限度降低了模板分子的殘留量，避免了分子印跡聚合物對待測樣品溶液的污染。

進一步的，步驟2)中，還包括對制備得到的分子印跡聚合物顆粒進行烘干的步驟，烘干的溫度為50-65℃。該烘干溫度下，一方面可以提高烘干的速度，另一方面可以避免過高溫度對分子印跡聚合物顆粒產生破壞。

上述制備方法制備得到的環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物。

上述環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物在分離提取中藥及其制劑中環烯醚萜苷的應用，尤其在六味地黃丸中環烯醚萜苷的提取分離中的應用。

利用上述環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物分離提取環烯醚萜苷的方法，包括如下步驟：

1)將制備得到的環烯醚萜苷假模版分子印跡聚合物顆粒作為柱層析填料裝柱；

2)將中藥材或中藥制劑的提取液上柱吸附；

3)首先用乙腈/乙醇溶液淋洗，最后用醋酸的水溶液洗脫，回收洗脫液得到提取后的環烯醚萜苷。

進一步的，步驟3)中，乙腈/乙醇溶液中乙腈和乙醇的體積比為8-10:1。

進一步的，步驟3)中，醋酸的水溶液中水和醋酸的體積比為99:1-90:10。

本發明的有益效果為：

1、本發明中將環烯醚萜苷類似物4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷作為分子印跡聚合物制備的模板分子，4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷可以采用簡便的化學合成法制備，較傳統的“天然環烯醚萜苷模板分子”成本低，來源可靠，而且該種模板可以較為徹底地洗脫，避免了對待測樣品溶液的污染。

2、本發明的另一主要創新點為采用的功能單體9-乙烯基蒽、n-乙烯基咔唑，均為首次應用于環烯醚萜苷分子印跡領域。

3、本發明用于提純環烯醚萜苷的分子印跡聚合物選擇性強，應用該材料提純環烯醚萜苷所獲得的環烯醚萜苷純度高。

4、本發明用于提純環烯醚萜苷的分子印跡聚合物生產成本低，洗脫液用量少。

5、本發明的用于提純環烯醚萜苷的分子印跡聚合物在應用于從六味地黃丸提液中提純環烯醚萜苷后可再生，且其再生方法簡單。

具體實施方式

應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷制備方法：

在20ml二氯甲烷中加入5克五乙酰基葡萄糖和0.5ml乙酸酐，攪拌溶解，0℃下緩慢滴加10ml45％溴化氫醋酸溶液。室溫下反應1小時，加入300ml二氯甲烷稀釋，依次用碳酸氫鈉溶液、水洗滌，有機相用mgso4干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得溴代四乙酰基葡萄糖。

將上一步所得溴代四乙酰基葡萄糖溶于18ml芐醇，加入2ghg(oac)2，95℃下反應2小時，濾除不溶物，粗產物經乙醇重結晶得4-苯基-d-四乙酰基吡喃葡萄糖苷。4-苯基-d-四乙酰基吡喃葡萄糖苷溶于100ml甲醇，加入5克甲醇鈉，室溫下反應4小時，經酸性離子交換樹脂純化，得3.1克4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷。

實施例1

(1)備料

本實施例各組分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷0.93g，功能單體(9-乙烯基蒽)1.65g，交聯劑(n,n-二甲基二丙烯酰胺酯)16.00g，引發劑(偶氮二異丁腈)0.08g，制孔劑(二甲基亞砜)45.00g。

(2)制備帶有模板分子的分子印跡聚合物

將步驟(1)中備好的模板分子、9-乙烯基蒽、n,n-二甲基二丙烯酰胺酯、偶氮二異丁腈、二甲基亞砜的混合溶劑加入反應釜中混合均勻，超聲脫氣15min，然后充氮除氧15分鐘，密封后于60℃恒溫水浴聚合24小時，得到帶有模板分子的分子印跡聚合物，然后將其碾磨過200目篩，即得到帶有模板分子環烯醚萜苷的分子印跡聚合物顆粒。

(3)提純脫去模板分子的分子印跡聚合物

用乙酸體積分數為10％的乙酸甲醇溶液洗脫由步驟(2)所制得的帶有模板分子的分子印跡聚合物顆粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集檢測六味地黃丸中環烯醚萜苷的分子印跡聚合物17.4g。

(4)取1.6克步驟(3)所制得的用于富集環烯醚萜苷的分子印跡聚合物裝柱。稱取10g六味地黃丸粉碎，加入50ml乙醇加熱回流提取2h后，過濾，濾液上柱。待上柱溶液流盡后，用乙腈/乙醇(9：1，v/v)進行淋洗，層析柱用1ml水/乙酸＝99:1(體積比)洗脫，收集洗脫液，hplc檢測，含量如下：

馬錢苷10mgg^-1、莫諾苷12mgg^-1、甲氧基莫諾苷4mgg^-1、斷氧化馬錢苷3mgg^-1、獐牙菜苷1mgg^-1、山茱萸苷1mgg^-1。

(5)分子印跡聚合物的再生

將上述洗去環烯醚萜苷的分子印跡聚合物，用95％乙醇洗脫，即可再生用于下一次提取用。

實施例2

(1)備料

本實施例各組分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷1.51g，功能單體(n-乙烯基咔唑)3.32g，交聯劑(n,n-二甲基二丙烯酰胺酯)15.32g，引發劑(偶氮二異戊腈)0.07g，制孔劑(四氫呋喃)40.03g。

(2)制備帶有模板分子的分子印跡聚合物

將步驟(1)中備好的模板分子、n-乙烯基咔唑、n,n-二甲基二丙烯酰胺酯、偶氮二異戊腈、四氫呋喃的混合溶劑加入反應釜中混合均勻，超聲脫氣13min，然后充氮除氧13分鐘，密封后于50℃恒溫水浴聚合20小時，得到帶有模板分子的分子印跡聚合物，然后將其碾磨過200目篩，即得到帶有模板分子環烯醚萜苷的分子印跡聚合物顆粒。

(3)提純脫去模板分子的分子印跡聚合物

用乙酸體積分數為15％的乙酸甲醇溶液洗脫由步驟(2)所制得的帶有模板分子的分子印跡聚合物顆粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集檢測六味地黃丸中環烯醚萜苷的分子印跡聚合物。

實施例3

(1)備料

本實施例各組分按如下用量配比配料：模板分子4-苯基-d-吡喃葡萄糖苷2.51g，功能單體(9-乙烯基蒽)4.32g，交聯劑(二乙烯基苯)20.12g，引發劑(偶氮二異戊腈)0.06g，制孔劑(四氫呋喃)50.03g。

(2)制備帶有模板分子的分子印跡聚合物

將步驟(1)中備好的模板分子、9-乙烯基蒽、二乙烯基苯、偶氮二異戊腈、四氫呋喃的混合溶劑加入反應釜中混合均勻，超聲脫氣13min，然后充氮除氧13分鐘，密封后于40℃恒溫水浴聚合19小時，得到帶有模板分子的分子印跡聚合物，然后將其碾磨過170目篩，即得到帶有模板分子環烯醚萜苷的分子印跡聚合物顆粒。

(3)提純脫去模板分子的分子印跡聚合物

用乙酸體積分數為20％的乙酸甲醇溶液洗脫由步驟(2)所制得的帶有模板分子的分子印跡聚合物顆粒，于60℃真空干燥后，即得到所述的用于富集檢測六味地黃丸中環烯醚萜苷的分子印跡聚合物。

以上所述僅為本申請的優選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。