本發明提供了一種受水楊酸和稻瘟病菌的雙誘導的水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子，同時還提供了以上啟動子的載體構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術：

啟動子是一個順式作用dna序列，具有阻遏子及轉錄因子等調節蛋白的結合位點，包含了一些重要的順式作用元件，在轉錄水平上調節基因的表達。啟動子按照其作用方式及功能可分為組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和特殊類型啟動子。在某些物理或化學信號的刺激下，誘導型啟動子可以誘導相關基因特異表達并且能調控目的基因的轉錄水平。wisl8基因啟動子活性可以被nacl、aba及干旱脅迫誘導增強。對小麥rbcs11基因啟動子分析表明干旱、高鹽、脫落酸和黑暗能抑制該啟動子的活性，在-1597～-1198bp區域存在響應脫落酸的順式作用元件。

在植物抗病過程中，茉莉酸、水楊酸作為重要的抗病信號分子起著重要的作用。對orca3基因啟動子研究發現該啟動子內部存在一個茉莉酸應答元件jre，并且該順式作用元件可以與擬南芥的atmyc2轉錄因子相結合從而激活orca3的表達。擬南芥atpnp-a基因啟動子中含有受水楊酸間接調控的w-box元件，提高水楊酸的濃度可以提高植物的抗逆性。擬南芥霜霉病抗性基因rpp8啟動子的w-box元件可能參與應答病原菌和水楊酸的誘導反應。對大麥β-1，3-葡聚糖酶同功酶基因(giii)啟動子(pgiii)研究表明水楊酸和稻瘟病來源的激發子可以誘導高水平的pgiii活性，該啟動子能響應水楊酸的誘導。水稻稻瘟病抗性基因pib受水楊酸、茉莉酸和乙烯誘導上調表達。

本申請的申請人通過前期研究，發現了一種水稻誘導抗病基因osaaa1，該基因可用于水稻抗稻瘟病和白葉枯病分子育種。目前該研究已經申報國家發明專利并已獲得授權，專利號為：zl201410591365.6。為了進一步研究該osaaa1基因的表達模式，也為進一步闡釋該基因的調控機制奠定基礎，因此需要針對該基因的啟動子進行以及誘導表達機理進行研究。

技術實現要素：

本發明提供了一種水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子，并成功構建了該啟動子的雙元表達載體dx2181g。為后續的研究osaaa1啟動子的表達模式和osaaa1基因的調控機制奠定了基礎。

實現本發明上述目的所采用的技術方案為：

一種水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子，所述啟動子受水楊酸誘導表達，該啟動子的核苷酸序列如seqidno:1所示，其長度為2893bp。

所述水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子的雙元表達載體dx2181g。

所述的雙元表達載體dx2181g的構建方法，包括以下步驟：(1)、針對水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子設計引物，上游引物為aa2psalf，其核苷酸序列如seqidno:2所示，下游引物為aa2psalr1，其核苷酸序列如seqidno:3所示；

(2)、對osaaa1基因啟動子進行pcr擴增，pcr反應體系為：ddh2o10.025μl，10×extaqbuffer1.5μl，extaq酶0.075μl，2.5mmol/μldntps1.2ul，10mmol/l的正反引物各0.6μl，100ng/μldna模板1μl；pcr擴增程序為：95℃3min；95℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸60s，34個循環；72℃延伸7min；將檢測正確的pcr產物用凝膠回收試劑盒回收；

(3)、將回收的pcr產物與dx2181質粒進行salⅰ酶酶切，反應體系為：10×hbuffer5μl，salⅰ2μl，線性質粒10μl，ddh2o補足至50μl；將目的片段酶切后進行清潔回收，將酶切的dx2181質粒進行去磷酸化處理后與回收的目的片段進行連接，反應體系為：目的片段1.5μl，dx2181質粒1.5μl，ligationhigh連接酶3μl，16℃連接90min；連接后轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，涂含50μg/ml的卡那霉素的lb平板，置于培養箱37℃倒置培養16h，挑取單克隆進行菌液pcr鑒定，提取質粒dna進行酶切鑒定，對鑒定到的陽性克隆測序確認。

本申請中成功構建了該啟動子的雙元表達載體dx2181g，通過農桿菌介導的遺傳轉化轉入水稻品種日本晴，轉基因植株陽性鑒定后，進行gfp觀察分析來研究osaaa1啟動子的表達模式和osaaa1基因的調控機制。

附圖說明

圖1為osaaa1基因啟動子的pcr擴增圖；

圖2為osaaa1基因啟動子重組載體菌落pcr鑒定圖；

圖3為重組載體質粒酶切電泳圖；

圖4為水稻稻瘟病誘導抗性基因osaaa1啟動子在水稻葉脈中特異表達結果圖；

圖5為osaaa1基因啟動子驅動gfp基因在煙草下表皮保衛細胞特異性表達圖；

圖6為不同處理方式下熒光強度的對比分析圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護范圍并不局限于以下實施例。

供試材料

大腸桿菌dh5α由中南民族大學生命科學學院提供，植物雙元表達載體dx2181g由華中農業大學提供，粳稻(oryzasativassp.japonica)品種日本晴由中南民族大學生命科學學院提供。

實驗試劑

凝膠回收試劑盒、凝膠清潔試劑盒、質粒小量提取試劑盒均購置axygen公司。限制性內切酶salⅰ、quickcutbamhⅰ、quickcutspelⅰ、quickcuthindⅲ、extaq酶、kod酶、dna分子量marker均購置takara公司。kod酶和ligationhigh購置toyobo公司。引物合成和測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

啟動子序列分析

利用生物信息學軟件place分析osaaa1的啟動子序列，其大小為2893bp，如seqidno:1所示。

啟動子片段的pcr擴增

以水稻osaaa1啟動子序列為模板，進行引物設計(見表1，引物1和引物2搭配擴增檢測上述啟動子片段下劃線為酶切位點)，在引物前面加上sal酶切位點和保護堿基，提取水稻葉片dna作為模板進行擴增。擴增的pcr反應體系為：ddh2o10.025μl，10×extaqbuffer1.5μl，extaq酶0.075μl，2.5mmol/μldntps1.2ul，10mmol/l的正反引物各0.6μl，100ng/μldna模板1μl。pcr擴增程序為：95℃3min；95℃變性30s，58.6℃退火30s，72℃延伸60s，34個循環；72℃延伸7min。將檢測正確的pcr產物用凝膠回收試劑盒回收。osaaa1基因啟動子片段的pcr擴增結果如圖1所示，圖1中m1為dnamarkerdl15000，泳道1為目的片斷。從圖1中可以看出，目的條帶大小與預期一致，可以用于后續實驗。

表1本申請所使用的引物列表

啟動子載體構建

將回收的目的片段以及dx2181質粒進行salⅰ酶酶切，反應體系為：10×hbuffer5μl，salⅰ2μl，線性質粒10μl，ddh2o補足至50μl。將目的片段酶切后進行清潔回收，將酶切的dx2181質粒進行去磷酸化處理后與回收的目的片段進行連接，反應體系為：目的片段1.5μl，dx2181質粒1.5μl，ligationhigh連接酶3μl，16℃連接90min。連接后轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，涂含50μg/ml的卡那霉素的lb平板，置于培養箱37℃倒置培養16h，挑取單克隆進行菌液pcr鑒定，鑒定結果如圖2所示，圖2中m1為dnamarkerdl15000，泳道1，2，3分別為陽性克隆菌落pcr擴增。從圖2中可以看出擴增得到的目的帶大小為2893bp。啟動子片段重組載體3個單克隆均擴出目的帶。

提取質粒dna進行酶切鑒定，對鑒定到的陽性克隆測序確認。將菌落pcr檢測到的陽性克隆擴大培養后提取質粒dna，用salⅰ酶進行酶切檢測，挑取了3個單克隆質粒，結果如圖3所示，圖3中，m1為dnamarkerdl15000，泳道1，2，3分別為陽性克隆酶切鑒定。圖3中可以看出：以上3個單克隆質粒均切出了載體帶和目的帶，為陽性質粒。菌落pcr和質粒酶切鑒定為陽性的克隆經sanger測序正確后保存，綜合以上結果表明osaaa1啟動子片段載體構建成功。

為了研究水稻稻瘟病誘導抗性基因osaaa1啟動子的表達模式，將水稻稻瘟病誘導抗性基因osaaa1啟動子全長2893bp片段插入雙元表達載體dx2181g中，與gfp進行融合表達，將重組載體進行遺傳轉化，轉化水稻品種為日本晴，待轉基因水稻出苗后進行移栽，水稻分蘗后，在15葉期左右，取水稻葉片，經過水楊酸誘導2h后，并制片在激光共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察。具體實驗步驟如下：

(1)準備市售的無色指甲油，將其均勻涂在載玻片上，剪取轉基因水稻葉片5cm左右，水稻下標皮朝上，上表皮朝下粘于載玻片上。

(2)在水稻朝上的下表皮處均勻涂上無色指甲油，用透明膠帶粘貼在水稻表面，靜至2小時。

(3)待指甲油干后，將透明膠帶快速撕掉，如處理得當，水稻下表皮細胞和部分葉脈會粘在透明膠帶中。

(4)將透明膠帶貼在新的載玻片上，至激光共聚焦顯微鏡進行觀察。

(5)按開機順序打開激光共聚焦顯微鏡，打開相應軟件，將載玻片置于載物臺上，用10×干鏡頭觀察，調節細準焦螺旋，是視物清晰，換成40×干鏡頭觀察，找到目標視野后進行拍攝。

(6)打開ec-z1軟件，開488nm激光，將光圈選為”m”，調節激光強度和增益值，進行拍攝保存。

圖4結果顯示在488nm激光條件下，水稻稻瘟病誘導抗性基因osaaa1啟動子在葉脈中特異表達。gfp表示在488nm激光條件下觀察的綠色熒光，bright表示白光下觀察的結果，merge表示前述二者疊加顯示的結果。

為了進一步的驗證本發明所提供的osaaa1基因啟動子的誘導表達效果，本發明還將載體轉化入煙草中，操作步驟與上述步驟相近似。并且在本實施例中設置了h20處理2h的對照組。圖5為osaaa1基因啟動子驅動gfp基因在煙草下表皮保衛細胞特異性表達圖，從圖5中可以看出，與對照組相比，r3-62轉基因煙草在水楊酸處理2h后熒光強度明顯上升。圖6為水楊酸處理組與對照組的熒光強度對比圖，從圖6中可以看出，水楊酸處理2h后，r3-63轉基因煙草下表皮氣孔處的保衛細胞的熒光強度增加了7.35倍。

<110>：中南民族大學

<120>：一種水稻誘導抗病基因osaaa1啟動子及其載體與構建方法

<160>：3

<210>：1

<211>：2893

<212>：dna

<213>：水稻

<400>：1

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<212>：dna

<213>：人工合成

<400>：2

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<211>：29

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<213>：人工合成

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