本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，尤其涉及一株匍枝根霉的篩選方法和匍枝根霉的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國是酒的故鄉(xiāng)，也是酒文化的發(fā)源地，是世界上釀酒最早的國家之一。酒的釀造，在我國已有相當悠久的歷史。在中國數(shù)千年的文明發(fā)展史中，酒與文化的發(fā)展基本上是同步進行的。糯米酒受到廣大消費者的青睞，對于糯米酒酒曲發(fā)酵，根霉是酒曲的主要糖化菌，酵母是主要發(fā)酵菌，因此酒曲質(zhì)量優(yōu)劣，取決于其中根霉及酵母品種的優(yōu)劣及數(shù)量的多少。不同酒曲中的根霉品種不同，糖化力大有差異。同種根霉作成酒曲因接種量、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)環(huán)境等的不同，糖化力也大有差異。酒曲的發(fā)酵力、酵母的活性也與糖化力有類似的問題。

發(fā)明專利“小孢根霉c97102734及應(yīng)用”(申請?zhí)枺篶n201610054903.7)公開了一株小孢根霉(rhizopusmicrosporus)c97102734，利用小孢根霉對石斛進行液化制備石斛液化液，采用酶解、發(fā)酵或二者結(jié)合的方式，將不溶于酒的石斛多糖轉(zhuǎn)化成為溶于酒的石斛低聚糖，解決了石斛多糖不溶于酒，不能用石斛生產(chǎn)合格酒的技術(shù)難題，得到的石斛酒具有良好的保健功能，實現(xiàn)了石斛深加工，大幅度提高了其附加值。發(fā)明專利”一株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶根霉及其發(fā)酵產(chǎn)酶方法“(申請?zhí)枺篶n201510731434.3)公開了一種匍枝根霉(rhizopusstolonifer)tp-02，保藏編號為：cgmccno.11119，該匍枝根霉(rhizopusstolonifer)tp-02是從黃山腐木中篩選得到的，該專利還公開了利用匍枝根霉(rhizopusstolonifer)tp-02生產(chǎn)匍枝根霉β-葡萄糖苷酶的方法，并對所產(chǎn)酶的酶學(xué)特性進行了分析。發(fā)明專利“食品發(fā)酵用的根霉及應(yīng)用”(申請?zhí)枺篶n201410676014.5)公開了一種食品發(fā)酵用的根霉的及應(yīng)用，該發(fā)明專利菌株為米根霉，從甜米酒中分離得到三株，分別為米根霉zsm-003、zsm-004和根霉zsm-005，適于大米制品和甜米酒發(fā)酵的；該專利還公開了一種食品發(fā)酵用的微生物復(fù)合菌劑，包含米根霉zsm-003、米根霉zsm-004和卡斯特酒香酵母(brettanomycescustersii)zsm-001，該復(fù)合發(fā)酵劑菌種存活率達到35％以上，生產(chǎn)的產(chǎn)品甜米酒中糖類組成較豐富，產(chǎn)品滋味濃郁、口感好、具較高的呈味氨基酸和必須氨基酸。發(fā)明專利“一種黑根霉及其應(yīng)用技術(shù)”(申請?zhí)枺篶n201410136456.0)公開了一種高產(chǎn)甾體發(fā)酵黑根霉菌株及其甾體化合物發(fā)酵的應(yīng)用技術(shù)，該菌株保藏號為：cgmccno.7687，主要用于甾體化合物(薯蕷皂甙)為原料生產(chǎn)植物激素的轉(zhuǎn)化過程，以甾體中間體沃氏氧化物為底物生產(chǎn)甾體中間體霉菌氧化物，生產(chǎn)霉菌氧化物具有轉(zhuǎn)化率高達71％、收率高達100％，而且生物學(xué)性狀比較穩(wěn)定，為以薯蕷皂甙為原料的植物甾體激素生產(chǎn)提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本提供了技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提高傳統(tǒng)糯米酒生產(chǎn)方法的發(fā)酵效率，篩選出一株糖化能力強的匍枝根霉。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一株匍枝根霉及其應(yīng)用，包括如下步驟：

一株匍枝根霉菌，該匍枝根霉保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為cgmccno.13767；保藏日期為：2017年3月27日；保藏單位名稱為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；分類命名為：匍枝根霉cy3,rhizopusstolonifercy3。本發(fā)明通過18srrna序列方法對菌株進行了分類鑒定。提取此菌的dna，擴增18srrna的序列，與參比匍枝根霉菌株對比，同源性為98％～100％。

本發(fā)明匍枝根霉菌株從糯米酒酒曲中篩選獲得，用于糯米酒的糖化工藝。

本發(fā)明酒曲為傳統(tǒng)糯米酒固體酒曲，由湖南省龍宮液酒業(yè)有限公司提供。

本發(fā)明菌株的篩選方法為：精確稱取糯米酒固體酒曲1.0g,放入無菌研缽中，加入10ml無菌水進行研磨，磨成糊狀,然后加入40ml無菌水進行攪拌，得酒曲懸濁液，用接種環(huán)挑取一環(huán)于分離培養(yǎng)基，用平板涂布法涂于無菌分離培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)15h；在無菌條件下，用接種環(huán)挑取最大的霉菌菌株，接入裝有20ml無菌水的25ml無菌試管中，進行攪拌稀釋，用接種環(huán)挑取一環(huán)于單菌落篩選培養(yǎng)基，用平板涂布法涂于無菌單菌落篩選培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)36h；在無菌條件下，用接種環(huán)挑取最大的霉菌菌株，接入裝有20ml無菌水的25ml無菌試管中，進行攪拌稀釋，吸取1ml于1l種子培養(yǎng)基中，30℃，150rpm條件下，培養(yǎng)25h，作為種子液備用，使用-80℃超低溫甘油凍結(jié)管保藏法保藏種子液。

本發(fā)明所以培養(yǎng)基組分及其處理方法：

無菌分離培養(yǎng)基：糯米汁300ml、氯霉素0.1g/l、瓊脂15.0g/l；滅菌方法為：精確稱取培養(yǎng)基各組分,加熱溶解于700ml蒸餾水中，用0.1mol/l的hcl和naoh溶液調(diào)ph到6.0,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌30分鐘,取出，在無菌條件下進行冷卻，倒平板。

單菌落篩選培養(yǎng)基：糯米汁300ml、氯霉素0.1g/l、瓊脂15.0g/l、青霉素80u/ml；滅菌方法為：精確稱量培養(yǎng)基各組分,加熱溶解于700ml蒸餾水中,用0.1mol/l的hcl和naoh溶液調(diào)ph到6.0,分裝三角瓶,121℃高壓滅菌30分鐘,取出，在無菌條件下進行冷卻，倒平板。。

種子培養(yǎng)基：糯米汁300ml，加入700ml蒸餾水，用0.1mol/l的hcl和naoh溶液調(diào)ph到6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉含量大于70％的糯米，通過清洗，浸漬過夜，蒸煮25min，冷卻后，加入同等質(zhì)量的水，待用。

本發(fā)明對所篩選菌株用于糯米酒生產(chǎn)的糖化工藝進行了說明：取1管超低溫甘油凍結(jié)管保存的菌種，置室溫溶解，倒入1kg發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過攪拌、打窩，在30℃條件下發(fā)酵65h，通過4層紗布過濾，測醪液總糖度。

本發(fā)明的技術(shù)效果和優(yōu)點：本發(fā)明提供的一株匍枝根霉及其應(yīng)用，與傳統(tǒng)糯米酒釀造方法相比，本發(fā)明菌株采用糯米汁培養(yǎng)基對根霉進行了篩選，所篩選的菌株更適應(yīng)糯米為底物的發(fā)酵的生產(chǎn)條件，通過添加具有高效糖化能力的菌株，有利于提高糖化轉(zhuǎn)化率，有利于提高糯米酒釀造工藝的原料利用率和生產(chǎn)效率。

具體實施方式

以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步詳細闡述。

實施例1：匍枝根霉菌株的分離和鑒定

(1)本發(fā)明所述匍枝根霉菌株是從傳統(tǒng)糯米酒固體酒曲中分離得到的，固體酒曲由湖南省龍宮液酒業(yè)有限公司提供。該菌株的種子培養(yǎng)條件為：取一支超低溫冷凍的菌種甘油管，室溫下解凍，轉(zhuǎn)入300ml種子培養(yǎng)基，在30℃、150rpm條件下，搖床培養(yǎng)25h；所述培養(yǎng)基組成為：糯米汁300ml，加入700ml蒸餾水，ph值6.0。

(2)采用18srrna基因測序法對本發(fā)明菌株進行分類鑒定。

18srrna序列測定委托上海生工生物工程股份有限公司進行測定，經(jīng)測定，該菌株的18srrna序列如下所示：

agtcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtataaataacttttatattgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatgatctacgtgacaaattctttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgcaaaaaagccctgacttacgaaggggtgcacttattagataaaatcaacgcggggtaaaacctgtttcttggtgaatcataataattaagcggatcgcatagccttgtgctggcgacggtccactcgattttctgccctatcatggttgagattgtaagatagaggcttacaatgcctacaacgggtaacggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgacacggggaggtagtgacaatacataacaatgcagggcctttaaggtcttgcaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggatcaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgcagttaaaacgtccgtagtcaaactttagtcttactggcgtagtggcctggtcttcattgaccaagctcattgctgccggagactccatgttcattaggggaaaatctctaggggtttttttcttatttgaacaattaccatgagcaaatcagagtgtttaaagcaggcttttaagcttgaatgtgttagcatggaataatgaaatatgactttagtcctattttcgttggtttaggtacttcagtaatgatgaatagaaacggttaggggcatttgtatttggtcgctagaggtgaaattcttggattgaccgaagacaaactactgcgaaagcatttgacccgggacgttttcattgatcaaggtctaaagttaagggatcgaagacgattagataccgtcgtagtcttaaccacaaactatgccgactagagattgggcgtgtttattatgactcgctcagcatcttagcgaaagtaaagtttttgggttctggggggagtatgggacgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacatagtaaggattgacagattgaaagctctttctagattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttcgtggagtgatttgtctggttaattccgataacgaacgagaccttattctgctaattagacaggccaactctttcgggttggtctatattatatatttcactggcttcttagagagactatcggcttcaagccgaaggaagttttaggcaataacaggtctgtgatgc

實施例2：本發(fā)明菌株在糯米酒糖化工藝中的應(yīng)用

準確稱量1kg淀粉含量大于70％的糯米，通過清洗，浸漬過夜，蒸煮25min，冷卻后，加入同等質(zhì)量的水，混合后稱取1kg；取1管超低溫甘油凍結(jié)管保存的菌種，置室溫溶解，倒入培養(yǎng)基中，通過攪拌、打窩，在30℃條件下發(fā)酵65h，通過4層紗布過濾，收集發(fā)酵醪液793ml，醪液總糖含量為413g/l、葡萄糖196g/l。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。