專利名稱：一株銀杏內生球毛殼菌防治植物病原真菌的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病害生物防治技術領域，具體涉及一株銀杏內生球毛殼菌NO. 05在防治玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)及匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)中的應用。
背景技術：
植物病原菌的抗藥性是植物病害化學防治中的一個嚴重問題，它給多種植物(如農作物、經濟作物及園藝作物等)病害的防治帶來很大困難。由于化學殺菌劑特別是內吸性殺菌劑長期而廣泛的使用，植物病原菌對其抗藥性非常突出。需要通過綜合防治尤其是與生物防治相結合，來克服其抗藥性的問題，從而對植物病原菌進行有效控制。
但是，目前生物防治菌多數尚處于研究與開發的初始階段，遠遠滿足不了生產上植物病蟲害防治的實際要求。加之市場上蔬菜、水果中農藥殘留量的嚴重超標，不利于綠色食品的健康發展，因此大力開發生物防治菌產品已勢在必行。內生真菌的存在具有普遍性和多樣性。植物內生真菌是一類應用前景廣闊的資源微生物，近年來己成為生物防治菌劑研制開發的熱點，而利用拮抗性內生真菌進行生物防治是生態農業可持續發展的一個重要方面。篩選獲得具有抑制病原菌活性的內生真菌是利用它進行植物病害防治的基礎工作，具有廣譜抗病蟲害作用的內生菌在生物防治病蟲害、促進農業可持續發展中具有極大的應用前景。國內外對真菌性殺菌劑的開發一直給予了很大關注，目前已有20多個屬的真菌被用于植物病害的生防實踐。毛殼菌屬(Chaetomium)主要腐生于植物殘體、紙張、土壤、動物糞便和富含纖維素的廢舊物品，以產豐富的降解纖維素的酶和具有生理活性的次生代謝產物而著稱，被認為具有潛在生物防治能力的類群。世界上已報道的毛殼菌約300多個種，可拮抗土壤中的某些微生物。Martin和Moore (1954)發現，巴西的各品種燕麥的種子被球毛殼菌(Chaetomium globosum)和螺卷毛殼菌(Chaetomium cochliodes)侵染后，則對維多利亞長螺孢毒素的作用產生了抵抗力，從而使谷物、燕麥、大麥的幼苗對鐮孢屬(Fusarium spp.)具有一定的抗性。Walther(1988)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum schlecht)是引起番茄枯萎病的致病菌，若用毛殼菌與化學殺菌劑PCNB同時使用，番茄枯萎病的發病率由43%降低到22%。終極腐霉(Pythium ultimum)是引起許多植物的種子腐爛和植物粹倒病的病原菌，此病原菌在越冬期以卵孢子和孢子囊孢子的形式在土壤中生存，當條件適宜的時候，在12小時內就可在甜菜種子表面形成菌落，繼而危害作物的正常生長。甘蔗枯萎病是由于甘鹿種子被甜菜莖點霉(Phoma botae)污染、土壤被終極腐霉(Pythium ultimum)或立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)污染所引起的，Pietro (1992)用毛殼菌的子囊孢子處理甘蔗種子，可以降低甘蔗枯萎病的發生率。同樣，棉花枯萎病也是由于棉花種子被終極腐霉(Pythium ultimum)或立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)污染而引起的，用毛殼菌的子囊孢子處理棉花種子，可有效控制這兩種棉花病原菌所造成的為害。用球毛殼處理南瓜屬種子，可以減少因Hylemya platura引起的種子子實體損傷和腐霉菌(Pythium spp.)造成的種子腐爛。如果種子在播種前未用毛殼菌處理，則種子在萌發期間，許多微生物很快定殖在種子表面，而且蠅的卵能夠促進種子表面假單胞菌的生長，使假單胞菌成為種子表面的優勢菌，從而促進植物病原菌的增殖，繼而引起種子腐爛和植物猝倒病的發生。若種子在萌發前用毛殼菌處理，再進行播種，毛殼菌的子囊孢子很快繁殖并在種子表面形成一層厚厚的菌絲，大大抑制了假單胞菌的對數生長，并且不影響種子周圍土壤的菌系。另外，Christian (1983) and Daniel (1984)葉面噴灑球毛殼制劑能控制由蘋果黑星菌(Venturiainaequlis)所引起的蘋果黑星病,如將球毛殼制劑(5X 106cps/ml)噴灑在蘋果葉子上,能減少Venturia inaequlis的孢子數而降低葉子的腐爛程度。由球毛殼產生的抗真菌物質
球毛殼素(Chaetomin)在抑制引起甘鹿粹倒病的病原菌-腐霉菌(Pythium ultimum)方
面起著重要作用。同樣，Soytong (2000)毛殼菌對草莓、榴蓮和黑胡椒等植物的病原菌均有一定的抑制作用。植物內生真菌產生的次生代謝產物具有豐富的生物學功能和化學結構多樣性，在農業和醫藥業中具有重要的應用潛力，其中一些化合物可能成為藥物研發的先導化合物。 植物內生真菌已成為尋找具有新穎化學結構及生物活性物質的新資源。

發明內容
本發明的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一種
從銀杏中分離篩選出的內生真菌---球毛殼菌(Chaetomium globosum)NO. 05 ;本發明的另
一目的是提供利用該菌株及其代謝產物拮抗玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的應用。本發明提供的一株銀杏內生球毛殼菌(Chaetomium globosum)NO. 05及其發酵代謝產物，可在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病northern corn leaf blight、葡萄白腐病 Grapevine white rot、番爺根霉果腐病 Tomato rhizopus fruit rot 中應用。一株銀杏內生球毛殼菌(Chaetomium globosum) NO. 05及其發酵代謝產物,將一株銀杏內生球毛殼菌(Chaetomium globosum)NO. 05接種于發酵培養基中，在25_30°C下發酵培養7-8d，得到的發酵液作為防治植物病原真菌的菌劑。所述的發酵培養基的配方為蒸懼水lOOOmL、燕麥30g、麥芽糖20g,發酵培養基的pH 為 7. O。本發明中球毛殼菌的分離篩選與鑒定于2008年6月在山東臨沂采集的銀杏葉中，經分離、純化、培養、發酵和活性測定等步驟獲得并保存；經形態學和18SrDNA分子生物學技術,鑒定為球毛殼菌(Chaetomiumglobosum),暫定名為球毛殼菌(C. globosum) NO. 05。該菌株在吉林大學植物科學學院有害生物綜合防治實驗室保存，保藏日期2010年10月2日，保藏登記號NO. 05。球毛殼菌NO. 05菌株基本培養形態特征為菌落淺色，氣生菌絲淺色，有無色或淺橙色分泌物；子囊果表生，球形、卵圓形或倒卵形，有孔口，7d開始成熟，反射光下橄欖褐色或灰褐色；附屬絲多，周生，直或微彎曲，褐色，具有疣狀突起；子囊棍棒狀，簇生，具有8個子囊孢子，具有柄，容易消解；子囊孢子褐色，檸檬形，厚壁，兩側平滑，兩端突起，有一個明顯的頂生萌發孔。本發明所述的球毛殼菌NO. 05，經發酵可獲得對植物病原真菌具有抑制作用的代謝產物。本發明的有益效果一是本發明從植物銀杏葉中分離篩選出代謝物對植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的球毛殼菌NO. 05，這為農業上防治玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病等植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；二是本發明提供了利用球毛殼菌NO. 05發酵獲得活性代謝產物的方法；該發酵代謝產物可應用于植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。


圖I為球毛殼菌NO. 05在4 X的照片圖2為球毛殼菌NO. 05在10 X的照片
具體實施例方式實施例I :球毛殼菌NO. 05的分離與篩選本發明于2008年6月在山東臨沂采集銀杏葉，經表面消毒、內生真菌分離、培養、發酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的篩選等步驟，從中獲得球毛殼菌NO. 05，保存。球毛殼菌NO. 05抑菌活性測定在PDA平板中央一側接種直徑為9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌塊，距離菌塊4. 5cm處點接球毛殼菌NO. 05，28°C恒溫培養2-4d，觀察有無抑菌帶，并測定大小，設置不接球毛殼菌NO. 05的處理為對照，抑菌帶越大，表示抑菌效果越強。抑制率由下列公式計算抑制率)=(對照組病原菌生長半徑一處理組病原菌生長半徑)/(對照組病原菌生長半徑一原菌餅半徑)X 100%測定結果表明球毛殼菌NO. 05對玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制率分別為 62. 69%、62. 01%和 49. 36%。實施例2 :球毛殼菌NO. 05發酵代謝產物的制備方法包括下列步驟(I)菌種的活化培養將分離保存的球毛殼菌NO. 05菌種移至馬鈴薯葡萄糖PDA固體平板上，在28°c 土 1°C條件下培養，至菌絲覆蓋整個培養皿，用直徑為9cm打孔器打孔獲得菌餅，供接種用；(2)發酵培養發酵培養液為每IOOOmL蒸餾水、燕麥30g、麥芽糖20g，pH為
6.0-7. O。每500mL三角瓶裝發酵培養液200mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無菌條件下挑取直徑為9cm的菌餅，在28°C 土 TC條件下，搖床轉速150rpm，發酵培養7-8d ；(3)發酵物提取發酵完畢后離心收集發酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，得乙酸乙酯萃取物，供抑菌活性測定。實施例3 :球毛殼菌NO. 05發酵代謝產物對玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制作用
所述球毛殼菌NO. 05發酵代謝產物為實施例2所制發酵液。抑菌活性測定取上述發酵液50iU于無菌濾紙片上，并吹干發酵液，在PDA平板中央接種直徑為9cm的玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉菌塊，距離菌塊3cm處點接球毛殼菌NO. 05的發酵液濾紙片，設置將只有發酵培養基并吹干的濾紙片作為陰性對照，28°C恒溫培養2-4d，觀察有無抑菌帶，并測定大小，以不點接球毛殼菌NO. 05的處理為對照。抑菌帶越大，表示抑菌效果越強。 抑制率由下列公式計算抑制率)=(對照組病原菌生長半徑一處理組病原菌生長半徑)/(對照組病原菌生長半徑一原菌餅半徑)X 100%測定結果表明球毛殼菌NO. 05發酵液對玉米大斑病菌、葡萄白腐病菌、匍枝根霉的抑制率分別為60. 60%,59. 00%和50. 13%。
權利要求
1.一株銀杏內生球毛殼菌Chaetomium globosum NO. 05及其發酵代謝產物,其特征在于在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病northern corn leaf blight、葡萄白腐病Grapevine white rot、番爺根霉果腐病 Tomato rhizopus fruit rot 中的應用。
2.按權利要求I所述的一株銀杏內生球毛殼菌ChaetomiumglobosumNO. 05及其發酵代謝產物，其特征在于將一株銀杏內生球毛殼菌Chaetomium globosumNO. 05接種于發酵培養基中，在25-30°C下發酵培養7-8d，得到的發酵液作為防治植物病原真菌的菌劑。
3.按權利要求2所述的一株銀杏內生球毛殼菌Chaetomiumglobosum NO. 05及其發酵代謝產物，其特征在于所述的發酵培養基的配方為蒸餾水lOOOmL、燕麥30g、麥芽糖20g，發酵培養基的pH為7.0。
全文摘要
一株銀杏內生球毛殼菌NO.05防治植物病原真菌的應用屬植物病害生物防治技術領域，本發明提供的一株銀杏內生球毛殼菌NO.05及其發酵代謝產物，可在防治由植物病原真菌引起的玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉果腐病中應用；本發明為農業上防治玉米大斑病、葡萄白腐病、番茄根霉菌果腐病等植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株；提供的發酵代謝產物可應用于植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
文檔編號A01P3/00GK102742606SQ20121018510
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月6日 優先權日2012年6月6日
發明者劉金亮, 張婧贏, 張桂珍, 張艷華, 張雅梅, 潘洪玉, 田野, 秦建春, 莫華文 申請人:吉林大學