本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測microrna的方法。

背景技術：

微小rna(microrna)是一種堿基數目為19～23個的非編碼的小分子rna，廣泛存在于動植物及病毒體內，microrna與生物體的多種生理過程密切相關，包括生長發育、免疫防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和調亡、脂肪代謝、腫瘤發展等。了解microrna的調節作用及microrna表達與人類疾病之間的關系已經引起了研究者極大興趣。calin等首次發現了microrna的表達與人類腫瘤的發生密切相關，并且已經發現microrna的表達在多類腫瘤中發生改變，一些microrna可以直接或間接作為腫瘤抑制基因或者作為癌基因。發展microrna檢測方法對于理解microrna的功能、臨床診斷以及發現新的靶標基因藥物是非常重要的。

基于核酸直接雜交檢測microrna的方法包括northern印跡法、微陣列芯片法及原位雜交法。由于microrna的一些固有特性：microrna的尺寸小、序列同源性高以及在細胞中的濃度低，基于核酸直接雜交檢測microrna方法具有操作繁瑣、耗時過長、樣品需要量大以及靈敏度和特異性不令人滿意等缺點。為了提高microrna檢測的靈敏度和特異性，研究者們開發了多種信號放大技術用于microrna檢測，例如反轉錄-聚合酶鏈反應(rt-pcr)、連接酶鏈式反應(lcr)、滾環擴增技術(rca)、恒溫指數擴增技術(iexpar)、鏈置換擴增技術(sda)等。其中rt-pcr、lcr兩種技術為變溫反應，需要依賴精密的熱循環儀，在升降溫過程中如果溫度控制不合適，會引起擴增失敗。而且這些技術都需要有酶的參與，即一種擴增技術需要一種酶甚至多種酶結合進行催化，否則擴增反應不能發生，同時這些擴增技術還需要對引物及探針序列進行復雜精細的設計，以及對實驗操作提出較高專業性要求。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于提供一種成本低廉、操作簡單，基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測microrna的方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成：

1、設計合成探針sh-dna和探針acrydite-dna

根據目標microrna的堿基序列，分別設計合成與目標microrna中8～13個堿基序列互補的探針sh-dna和探針acrydite-dna，其中探針sh-dna的3’端修飾巰基，探針acrydite-dna的5’端修飾丙烯酰胺基，且這兩條探針的堿基數目相差0～3個；當探針sh-dna和探針acrydite-dna與目標microrna互補后，探針sh-dna的5′端和探針acrydite-dna的3′端相互毗鄰，且這兩條探針與目標microrna互補的堿基數目之和與目標microrna的堿基數目相同，同時探針sh-dna的3’端和探針acrydite-dna的5’端分別帶有3～5個與目標microrna互補的堿基相毗鄰的堿基t。

2、巰基標記金磁微粒

將探針sh-dna用磷酸三氯乙酯活化，活化后的sh-dna與金磁微粒結合，得到巰基標記的金磁微粒(sh-金磁微粒)。

3、合成dna功能化的水溶性熒光聚合物

以過硫酸銨(aps)和n,n,n’,n’-四甲基乙二胺(temed)的混合物為引發劑，將丙烯酰胺、丙烯酰基熒光素、探針acrydite-dna進行無規共聚，得到dna功能化的水溶性熒光聚合物。

4、熒光檢測目標microrna

將步驟2得到的巰基標記的金磁微粒和步驟3得到的dna功能化的水溶性熒光聚合物與不同濃度的目標microrna標準樣品進行雜交反應，經磁分離得到雜交產物，對雜交產物經去雜交、磁分離后所得到的上清液進行熒光檢測，繪制熒光強度隨目標microrna標準樣品濃度變化的標準曲線；按照該步驟檢測待測microrna樣品的熒光強度，結合繪制的標準曲線的線性方程，即可實現對microrna的定性和定量檢測。

上述步驟3中，優選丙烯酰胺、丙烯酰基熒光素、探針acrydite-dna的摩爾比為10000:1000:1。

上述步驟4中，優選雜交反應的溫度為30～40℃，雜交時間為60～120分鐘。

上述步驟4中，所述熒光檢測的激發波長為494nm、發射波長為512nm。

本發明的檢測原理如圖1所示，sh-dna通過au-s鍵自組裝到金磁微粒的表面，形成sh-金磁微粒；acrydite-dna、丙烯酰基熒光素及丙烯酰胺在引發劑aps和temed存在下發生聚合反應，形成可識別目標microrna的dna功能化的水溶性熒光聚合物。當有目標microrna存在時，microrna同時與sh-dna及acrydite-dna發生堿基互補配對，經過磁分離去掉未配對的熒光聚合物后，用naoh水溶液去雜交，去雜交后dna功能化的水溶性熒光聚合物從金磁微粒上脫離，分散在naoh水溶液中，磁分離后，收集上清液，測定上清液的熒光強度，目標microrna的濃度越大，熒光強度越大。

本發明的有益效果如下：

1、本發明建立了一種基于水溶性熒光聚合物信號放大作用直接檢測目標microrna的熒光分析方法，該方法所用dna功能化的水溶性熒光聚合物的聚合物鏈中標記的熒光素基團多，可以將檢測的熒光信號進行多倍放大，實現對檢測信號的第一級放大。同時，由于熒光報告基團受到聚合物的包裹和保護，降低了碰撞猝滅，實現了檢測信號的第二級放大。

2、本發明根據目標microrna的不同可以設計不同acrydite-dna與sh-dna序列，達到檢測不同種類microrna的目的，而且本發明檢測方法的檢出限低、選擇性高。同時，該方法無需對目標microrna進行擴增，檢測成本和專業性要求低，操作步驟簡單，分析速度快。

附圖說明

圖1是本發明方法檢測microrna的原理圖。

圖2是本發明方法檢測microrna-21的工作曲線。

圖3是本發明方法的選擇性。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不僅限于這些實施例。

實施例1

以檢測microrna-21(其堿基序列為5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')為例，具體檢測方法如下：

1、設計合成探針sh-dna和探針acrydite-dna

根據目標microrna-21的堿基序列，分別設計合成探針sh-dna和探針acrydite-dna，其中探針sh-dna的堿基序列為5'-ctgataagctattttt-sh-3'，探針acrydite-dna的堿基序列為5'-acrydite-ttttttcaacatcagt-3'，acrydite代表丙烯酰胺基。

2、巰基標記金磁微粒

將10μl100μmol/l探針sh-dna的pbs緩沖液(ph＝7.4，10mmol/l)置于500μl離心管中，再加入10μl10mmol/l磷酸三氯乙酯的水溶液，常溫活化1小時，然后將活化后的sh-dna溶液加入到1ml1mg/ml金磁微粒分散液(金磁微粒分散于水中制成)中，常溫振蕩16小時后，加入100mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液使所得混合液中pbs濃度為10mmol/l，繼續振蕩1小時，分三次加入1mol/lnacl水溶液，每次加完后靜置6小時，使最終混合液中nacl的濃度為0.1mol/l；最后在磁分離架上靜置并進行磁分離，將所得上清液用移液槍吸出，固體用10mmol/lph＝7.4的pbst緩沖液(含體積分數為0.05％吐溫-20、0.1mol/lnacl)洗滌3次后分散于1ml10mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液中，得到巰基標記的金磁微粒分散液。

3、合成dna功能化的水溶性熒光聚合物

將3.0000g(9×10^-3mol)熒光素完全溶解于盛有20.00ml干燥的二氯甲烷的圓底燒瓶中，再加入3.00ml三乙胺，磁力攪拌，在冰水浴中充分冷卻；將0.90ml丙烯酰氯溶解于20.00ml二氯甲烷后滴加至圓底燒瓶中，待其在冰水浴中滴加完成后，常溫攪拌反應24小時。反應結束后，旋蒸除去部分二氯甲烷后，傾入大量水中，析出沉淀，過濾，干燥后，在乙醇中重結晶，得到橙黃色的丙烯酰基熒光素。

將7.1mg(1×10^-4mol)丙烯酰胺、26μl(1×10^-5mol)丙烯酰基熒光素、30μlph＝8的tris-hcl緩沖液、5μl2mol/l的nacl水溶液、5μl0.1mol/l的十二烷基磺酸鈉水溶液、100μl100μmol/l探針acrydite-dna的tris-hcl緩沖液(ph＝8)加入1.5ml離心管中，通氬氣2分鐘后，加入5μl引發劑(按每毫升水中加入0.1g過硫酸銨和0.1mln,n,n’,n’-四甲基乙二胺配制而成)，常溫聚合24小時后，將所得聚合液依次用乙醇和水透析，直到透析液中沒有熒光為止，以除去未聚合的單體，最后將其冷凍干燥24小時，得到橘黃色dna功能化的水溶性熒光聚合物。經高效凝膠色譜儀(ultimate3000)測定，該水溶性熒光聚合物的數均分子量為109883，多分散指數2.86。

4、熒光檢測microrna

向5個1.5ml離心管中分別加入10μl步驟2得到的巰基標記的金磁微粒分散液，再依次向5個離心管中加入10μl10^-14mol/l、10^-13mol/l、10^-12mol/l、10^-11mol/l、10^-10mol/lmicrorna-21水溶液，然后再加入20μl步驟3得到的dna功能化的水溶性熒光聚合物的pbs緩沖液(10mmol/l，ph＝7.4)和160μl10mmol/lph＝7.4的pbs緩沖液(含100mmol/lnacl、10mmol/lmgcl2)，所得混合溶液在30℃水浴中孵育90分鐘，使探針sh-dna和探針acrydite-dna與microrna-21充分雜交。待雜交完成后，將離心管放在磁分離架上靜置3分鐘進行磁分離，將所得上清液用移液槍吸出，雜交產物用10mmol/lph＝7.4的pbst緩沖液(含體積分數為0.05％吐溫-20、0.1mol/lnacl)洗滌3次，再加入200μl0.15mol/l的naoh水溶液將其浸泡15分鐘進行去雜交，去雜交后再進行磁分離，所得上清液采用rf-5301型熒光分光光度計在激發波長為494nm、發射波長為512nm下進行熒光檢測，繪制熒光強度隨microrna-21濃度變化的標準曲線，結果見圖2。

由圖2可見，熒光強度與microrna-21的濃度之間存在良好的線性關系，其線性回歸方程為y＝83.17lgc+1231.62，式中c為microrna-21的濃度(單位mol/l)，y為熒光強度，相關系數r²為0.9943。按iupac建議，根據3σ，計算出該方法的檢出限為1.44fmol/l。實驗結果表明，該方法對microrna-21具有高靈敏檢測的能力。

為了證明本發明檢測方法的選擇性，發明人采用實施例1的方法分別對microrna-21(5'-uagcuuaucagacugauguuga-3')、單堿基錯配的microrna(5'-uagcuuaucagaccgauguuga-3')、三堿基錯配的microrna(5'-uagccuaucagaccgaaguuga-3')、任意序列的microrna(5'-cugaccuaugaauugacagcca-3')進行了檢測，結果見圖3。由圖3可見，microrna-21對應體系產生較強的熒光信號，將其定為100％時，單堿基錯配的microrna以及三堿基錯配的microrna對應體系的熒光強度分別為33％和14％，任意序列的microrna對應體系的熒光強度與空白基本相同，表明該方法能夠很好的區分這四種核酸序列，從而實現對目標microrna的選擇性檢測。

核苷酸或氨基酸序列表

[0001]

序列表

<110>陜西師范大學

<120>基于水溶性熒光聚合物快速靈敏檢測microrna的方法

<160>6

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>待測microrna-21序列

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根據待測microrna-21序列設計的探針sh-dna，以用作磁分離雜交產物

<400>2

ctgataagctattttt16

<210>3

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>根據待測microrna-21序列設計的探針acrydite-dna，以用作識別檢測microrna-21

<400>3

ttttttcaacatcagt16

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>單堿基錯配的microrna，作為檢測microrna-21時的選擇性的對比序列

<400>4

uagcuuaucagaccgauguuga22

<210>5

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>三堿基錯配的microrna，作為檢測microrna-21時的選擇性的對比序列

<400>5

uagccuaucagaccgaaguuga22

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<221>misc_feature

<223>任意序列的microrna，作為檢測microrna-21時的選擇性的對比序列

<400>6

cugaccuaugaauugacagcca22