本發明屬于生物技術領域，具體涉及到一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法。

背景技術：

皮膚作為人體最大的組織器官，是人體的第一道防護屏障，它可以防止體內水份、電解質的丟失，同時也保護機體不受外界有害物質的侵害，皮膚容易受到外傷、燒傷、炎癥、潰瘍、腫瘤術后及先天疾病等因素的損害。組織工程皮膚的出現為創面修復領域研究提供了一種新的治療途徑。目前國內外市場已有很多種皮膚替代物，一種只具有真皮層的單層組織工程皮膚，這種皮膚替代物隔離外界細菌能力差，容易引起感染；另一種為雙層組織工程皮膚，既含有表皮層又含有真皮層的組織工程化皮膚，這種皮膚替代物雖然效果較好，但是細胞生長及保存條件苛刻，使其成本高昂，保質期短，而且所用支架膠原凝膠的收縮率較大，使用同種異體細胞和牛膠原，存在著不可預知的免疫排斥反應和潛在病毒感染的風險而且脆性大，操作困難。就對于目前的技術方法并不能在組織工程皮膚中構建出皮膚的附屬器結構，如毛囊、汗腺、皮脂腺等。這些結構在皮膚創傷修復和重建過程中又起著至關重要的作用。因此，本發明對于含有毛囊附屬器的組織工程皮膚的構建對于后續研發含有附屬器的組織工程皮膚奠定了基礎。

公告號為cn101773688b的中國專利公開了一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，是在凝膠溶液中接種羊膜間充質干細胞、向毛乳頭方向誘導的羊膜間充質干細胞、羊膜上皮細胞、向汗腺上皮方向誘導的羊膜上皮細胞，經真皮層培養后，再經形成毛囊、汗腺結構的誘導培養，于其表面再接種羊膜上皮細胞和經向角質形成細胞誘導的羊膜上皮細胞，培養后得到具有毛囊、汗腺結構的組織工程皮膚，該發明使用的培養基80％體積分數來源于動物細胞外基質，成分復雜，容易傳播疾病，容易發生排斥反應。

公告號為cn105056307a的中國專利公開了一種人造皮膚及其制備方法，該人造皮膚包括表皮細胞、真皮細胞和生物支架材料；其是將所述真皮細胞復合于所述生物支架材料內部，在表面接種所述表皮細胞，培養制備獲得的。該人造皮膚具有真皮層和表皮層，帶有活性細胞，且表皮層中含有角質層，接近于正常皮膚，但是該發明所述的生物支架材料是膠原蛋白、細胞外基質復合物、透明質酸、多糖、硫酸軟骨素、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸和聚羥基乙酸的共聚物中的一種或兩者以上混合物。

技術實現要素：

為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種含附屬器的組織工程皮膚及其制備方法，使用尿液細胞為種子細胞，獲取方便，培養周期短，含有的毛囊結構有利于創面的愈合，并且本發明為后續開發含有附屬器組織工程皮膚奠定了基礎。

本發明技術方案如下所示：

一種含附屬器的組織工程皮膚的制備方法，步驟為：

步驟一：尿液細胞的收集

1)收集杯中加入2ml青霉素/鏈霉素雙抗后，收集90-150ml尿液；

2)將尿液倒入3-5個50ml離心管中，離心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液體1-5ml，合并到一個離心管內，加入10-30ml含有體積分數為5％青霉素/鏈霉素的pbs中，混勻后，離心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液體0.5-1ml；

3)將六孔板1孔用0.1％明膠包被20min-30min后，吸去孔內液體，將步驟2)得到的剩余液體倒入包被好的孔中，加入2mlregm培養基再加入3μlprimocin后，放入37℃培養箱內培養，待尿液中細胞貼壁后，進行換液處理；

4)當尿液細胞融合度達到80％，則可進行傳代培養；

步驟二：多能干細胞的誘導與培養

①細胞轉染：將表達轉錄調控因子oct4、sox2、nanog、klf4和lin28導入尿液細胞，然后分至預先用matrigel包被的6孔板中，用培養液b補至每孔2ml培養，細胞培養密度為1×10⁶/ml；

②細胞增殖：細胞轉染第2天，將培養基b更換為mtesr1培養基，并且連續7天每天更換mtesr1培養基，得到克隆細胞；

③細胞優化：鏡下觀察并挑選形態與人胚胎干細胞相近的克隆細胞，作為多能干細胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，細胞接種密度為1×10⁶/ml，每孔加1mlmtesr1培養基進行傳代培養；

步驟三：間充質干細胞的誘導與培養

(1)當誘導多能干細胞長至80％時，將mtesr1培養基去除，加1mldmem/f12培養液清洗一遍后，加含0.5mmedta的dpbs消化5min，400r/min，離心5min，收集細胞沉淀，加入mtesr1培養基以1：3的比例進行傳代，傳至已被matrigel包被好的六孔板中；

(2)待多能干細胞長至六孔板的70％-80％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基d，培養2天后，得到間充質干細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基e重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液；

(3)將單細胞懸液接種至0.1％明膠預先包被的10ml細胞培養皿中，當細胞融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化細胞，然后加入培養基e按照1：3的比例進行細胞傳代培養；

步驟四：(一)組織工程表皮細胞的培養

<1>將間充質干細胞培養基中的培養基e去除，加1mldmem/f12培養液清洗一遍后，加含0.5mmedta的dpbs消化5min，400r/min，離心5min，收集細胞沉淀，加入培養基e以1：3的比例進行傳代，傳至已被matrigel包被好的六孔板中；

<2>待間充質干細胞長至六孔板的70％-80％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基f，每兩天更換一次培養基，培養4天后，得到表皮細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基g重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液；

<3>將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基g重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液，備用；

(二)組織工程成纖維細胞的培養

[1]同步驟四(一)中的<1>；

[2]待間充質干細胞長至六孔板的70％-80％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基h，每兩天更換一次培養基，培養5天后，得到成纖維細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基i重懸細胞，制成5×10⁵/ml單細胞懸液；

[3]將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞生長3天融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基i重懸細胞，制成5×10⁵單細胞懸液，備用；

(三)組織工程毛囊細胞的誘導培養

{1}同步驟四(一)中的<1>；

{2}待間充質干細胞長至六孔板的70％-80％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基j，每兩天更換一次培養基，培養5天后，得到毛囊細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基k重懸細胞，制成5×10⁵/ml單細胞懸液；

{3}將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞生長3天融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基k重懸細胞，制成5×10⁵單細胞懸液，備用；

步驟五：含有附屬器的組織工程雙層皮膚的構建

<i>將羊膜打孔成與6板孔直徑相同的羊膜圓片；

<ii>將成纖維細胞與毛囊細胞按0.9-1.1:1的比例混合，接種到羊膜基質層，加入培養液i進行培養，待細胞的融合度達到75-85％，在羊膜的上皮面接種表皮細胞，加入培養基g進行培養；

<iii>培養2天后表皮細胞緊貼于羊膜上皮面，將培養基g棄去，加入2ml培養液l繼續培養，每天換液，培養2天，即得。

進一步的，所述的dmem/f12培養液體積比為9:1，并且以dmem/f12體積比為9:1混合為基礎培養基，使用基礎培養基配制以下培養基，其中添加物濃度為終濃度：

培養基b：商用型regm培養基與mef培養基以1：1的體積比混合；

培養基d：基礎培養基500ml、l-谷酰胺2mmol/l、堿性成纖維細胞生長因子75ug/l、地塞米松10^-8mol/l；

培養基e：基礎培養基500ml、人表皮生長因子20ng/ml、肝細胞生長因子3ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子2ng/ml、血小板衍生因子5ng/ml、胰島素樣生長因子5ng/ml、轉化生長因子-β5ng/ml；

培養基f：基礎培養基500ml、角質化細胞生長因子20ug/l、轉化生長因子-β45ug/l、血小板衍生因子-ab8ug/l、血管內皮生長因子15ug/l、白細胞介素-25ug/l、氫化可的松0.4ug/ml；

培養基g：基礎培養基500ml、氫化可的松0.5ng/ml、霍亂毒素1×10^-10mol/l、胰島素0.05ng/ml、三碘甲狀腺原氨酸1×10^-7mol/l、腺嘌呤1.8×10^-4mol/l、青霉素100iu/ml、人表皮生長因子15ng/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、谷氨酸5ug/ml、rock抑制劑5μm、羧甲基殼聚糖0.1mg/ml；

培養基h：基礎培養基500ml、堿性成纖維細胞生長因子10ug/l、維生素c1mmol/l、非必需氨基酸0.02mmol/ml；

培養基i：基礎培養基500ml、胰島素5ng/ml、氫化可的松300ug/ml、腺嘌呤15ug/ml、維生素c120ug/ml、人表皮生長因子5ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子8ng/ml、bpe20ug/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、羧甲基殼聚糖0.5mg/ml；

培養基j：基礎培養基500ml、成纖維細胞生長因子5ug/ml、肝細胞生長因子5ug/ml、wnt3a30-200ng/ml、角質細胞生長因子12.5μg/ml、胰島素樣生長因子50ng/ml、血管內皮生長因子10ng/ml、表皮細胞生長因子20μg/l、神經生長因子15ng/ml、青霉素100iu/ml、鏈霉素100iu/ml、l-谷氨酰胺3mmol/l、胸腺素β40.015％；

培養基k：基礎培養基500ml、l-谷氨酰胺2.5mmol/l、胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑1ng/ml、肝細胞生長因子5ug/ml、胰島素3ng/ml；

培養基l：基礎培養基500ml、胰島素0.05μmol/l、非必需氨基酸0.05mmol/ml、人表皮生長因子10ng/ml、青霉素100iu/ml、牛垂體提取物20ug/ml、氯化鈣300μg/ml。

進一步的，步驟五中所述的羊膜使用前浸泡在含有0.5-2％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時。

進一步的，步驟五中所述的羊膜為脫細胞羊膜。

進一步的，步驟五中所述的成纖維細胞與毛囊細胞接種總密度為0.2×10⁷-2×10⁷/ml。

進一步的，步驟五中所述的表皮細胞接種密度為1×10⁶-2×10⁶/ml。

另外，本發明還提供了由本發明的含附屬器的組織工程皮膚的制備方法制得的含附屬器的組織工程皮膚。

本發明使用的培養基為：所述的培養基a為尿液細胞培養基；所述的培養基b為多能干細胞誘導培養基；所述的培養基c為多能干細胞細胞培養基；所述的培養基d為間充質干細胞誘導培養基；所述的培養基e為間充質干細胞培養基；所述的培養基f為表皮細胞誘導培養基；所述的培養基g為表皮細胞培養基；所述的培養基h為成纖維細胞誘導培養基；所述的培養液i為成纖維細胞培養基；所述的培養基j為毛囊細胞誘導培養基；所述的培養基k為毛囊細胞培養基；所述的培養液l為組織工程雙層皮膚培養基。

本發明使用的生物支架材料為羊膜，對皮膚具有良好的親和性，羊膜是胎盤的最內層，具有一定的彈性，含有大量不同的膠元，羊膜常作為移植的生物材料，為了減少羊膜中細胞對異體的排斥，本發明使用了脫細胞羊膜，并且通過試驗發現羊膜使用前浸泡在含有0.5-2％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時，可以較好的提高組織工程皮膚內部的細胞密度，并且提高其愈合能力。

本發明使用的細胞培養基配方合理，滿足了細胞生長所需要的營養，并且可以有效的提高細胞的生長速度，縮短培養時間。

與現有技術相比，本發明具有以下優點：

(1)本發明所用的誘導多能干細胞是經尿液中提取的尿液細胞誘導分化獲得的，干細胞的獲取方便，效率高且對人體無傷害。

(2)本發明中所用培養中加有羧甲基殼聚糖能促進細胞生長，縮短了細胞的培養周期。

(3)本發明中所制備的組織工程皮膚含有毛囊結構能夠調節創面新陳代謝、溫度，加快創面的功能恢復。

(4)本發明中所用的生物支架為脫細胞羊膜，方便獲取且免疫原性低。

附圖說明

圖1是表皮細胞標志分子ck19免疫熒光鑒定顯微鏡圖；

圖2是表皮細胞標志分子ck19流式細胞學鑒定顯微鏡圖；

圖3是成纖維細胞標志分子vimentin免疫熒光鑒定顯微鏡圖；

圖4是成纖維細胞標志分子vimentin的rt-pcr電泳圖；

圖5是毛囊細胞標志分子ck15免疫熒光鑒定顯微鏡圖；

圖6是毛囊細胞標志分子ck15的rt-pcr的電泳圖；

圖7是組織工程皮膚細胞分布圖。

具體實施方式

本發明通過以下實施例進行進一步的說明，使本領域技術人員更加理解本發明技術方案，本發明使用的成分均屬于常規產品，其中，所用的非配制培養基均購于北京裕恒豐科技有限公司，品牌sciencell，wnt3a購自華雅再生醫學生物工程技術有限公司。

實施例1培養基成分與種類

以dmem/f12體積比為9:1混合為基礎培養基，使用基礎培養基配制以下培

養基，其中添加物濃度為終濃度：

培養基b：商用型regm培養基與mef培養基以1：1的體積比混合；

培養基d：基礎培養基500ml、l-谷酰胺2mmol/l、堿性成纖維細胞生長因子75ug/l、地塞米松10^-8mol/l；

培養基e：基礎培養基500ml、人表皮生長因子20ng/ml、肝細胞生長因子3ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子2ng/ml、血小板衍生因子5ng/ml、胰島素樣生長因子5ng/ml、轉化生長因子-β5ng/ml；

培養基f：基礎培養基500ml、角質化細胞生長因子20ug/l、轉化生長因子-β45ug/l、血小板衍生因子-ab8ug/l、血管內皮生長因子15ug/l、白細胞介素-25ug/l、氫化可的松0.4ug/ml；

培養基g：基礎培養基500ml、氫化可的松0.5ng/ml、霍亂毒素1×10^-10mol/l、胰島素0.05ng/ml、三碘甲狀腺原氨酸1×10^-7mol/l、腺嘌呤1.8×10^-4mol/l、青霉素100iu/ml、人表皮生長因子15ng/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、谷氨酸5ug/ml、rock抑制劑5μm、羧甲基殼聚糖0.1mg/ml；

培養基h：基礎培養基500ml、堿性成纖維細胞生長因子10ug/l、維生素c1mmol/l、非必需氨基酸0.02mmol/ml；

培養基i：基礎培養基500ml、胰島素5ng/ml、氫化可的松300ug/ml、腺嘌呤15ug/ml、維生素c120ug/ml、人表皮生長因子5ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子8ng/ml、bpe20ug/ml、轉鐵蛋白10ug/ml、羧甲基殼聚糖0.5mg/ml；

培養基j：基礎培養基500ml、成纖維細胞生長因子5ug/ml、肝細胞生長因子5ug/ml、wnt3a30-200ng/ml、角質細胞生長因子12.5μg/ml、胰島素樣生長因子50ng/ml、血管內皮生長因子10ng/ml、表皮細胞生長因子20μg/l、神經生長因子15ng/ml、青霉素100iu/ml、鏈霉素100iu/ml、l-谷氨酰胺3mmol/l、胸腺素β40.015％；

培養基k：基礎培養基500ml、l-谷氨酰胺2.5mmol/l、胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑1ng/ml、肝細胞生長因子5ug/ml、胰島素3ng/ml；

培養基l：基礎培養基500ml、胰島素0.05μmol/l、非必需氨基酸0.05mmol/ml、人表皮生長因子10ng/ml、青霉素100iu/ml、牛垂體提取物20ug/ml、氯化鈣300μg/ml。

實施例2一種含附屬器的組織工程皮膚

所述的組織工程皮膚的制備方法為：所涉及到的培養基成分如實施例1，步驟為：

步驟一：尿液細胞的收集

1)收集杯中加入2ml青霉素/鏈霉素雙抗后，收集120ml尿液；

2)將尿液倒入4個50ml離心管中，離心400r/min，10min，吸去上清液至每管剩余液體3ml，合并到一個離心管內，加入20ml含有體積分數為5％青霉素/鏈霉素的pbs中，混勻后，離心400r/min，10min，吸去上清液至剩余液體0.75ml；

3)將六孔板1孔用0.1％明膠包被25min后，吸去孔內液體，將步驟2)得到的剩余液體倒入包被好的孔中，加入2mlregm培養基再加入3μlprimocin后，放入37℃培養箱內培養，待尿液中細胞貼壁后，進行換液處理；

4)當尿液細胞融合度達到80％，則可進行傳代培養；

步驟二：多能干細胞的誘導與培養

①細胞轉染：將表達轉錄調控因子oct4、sox2、nanog、klf4和lin28導入尿液細胞，然后分至預先用matrigel包被的6孔板中，用培養液b補至每孔2ml培養，細胞培養密度為1×10⁶/ml；

②細胞增殖：細胞轉染第2天，將培養基b更換為mtesr1培養基，并且連續7天每天更換mtesr1培養基，得到克隆細胞；

③細胞優化：鏡下觀察并挑選形態與人胚胎干細胞相近的克隆細胞，作為多能干細胞，并接種于用matrigel包被的12孔板中，細胞接種密度為1×10⁶/ml，每孔加1mlmtesr1培養基進行傳代培養；

步驟三：間充質干細胞的誘導與培養

(1)當誘導多能干細胞長至80％時，將mtesr1培養基去除，加1mldmem/f12培養液清洗一遍后，加含0.5mmedta的dpbs消化5min，400r/min，離心5min，收集細胞沉淀，加入mtesr1培養基以1：3的比例進行傳代，傳至已被matrigel包被好的六孔板中；

(2)待多能干細胞長至六孔板的75％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基d，培養2天后，得到間充質干細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基e重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液；

(3)將單細胞懸液接種至0.1％明膠預先包被的10ml細胞培養皿中，當細胞融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化細胞，然后加入培養基e按照1：3的比例進行細胞傳代培養；

步驟四：(一)組織工程表皮細胞的培養

<1>將間充質干細胞培養基中的培養基e去除，加1mldmem/f12培養液清洗一遍后，加含0.5mmedta的dpbs消化5min，400r/min，離心5min，收集細胞沉淀，加入培養基e以1：3的比例進行傳代，傳至已被matrigel包被好的六孔板中；

<2>待間充質干細胞長至六孔板的75％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基f，每兩天更換一次培養基，培養4天后，得到表皮細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基g重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液；

<3>將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基g重懸細胞，制成1×10⁶/ml單細胞懸液，備用；

(二)組織工程成纖維細胞的培養

[1]同步驟四(一)中的<1>；

[2]待間充質干細胞長至六孔板的75％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基h，每兩天更換一次培養基，培養5天后，得到成纖維細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基i重懸細胞，制成5×10⁵/ml單細胞懸液；

[3]將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞生長3天融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基i重懸細胞，制成5×10⁵單細胞懸液，備用；

(三)組織工程毛囊細胞的誘導培養

{1}同步驟四(一)中的<1>；

{2}待間充質干細胞長至六孔板的75％時，pbs沖洗一遍后，更換培養基j，每兩天更換一次培養基，培養5天后，得到毛囊細胞，加含0.5mmedta的dpbs進行消化，400r/min，離心5min，加入培養基k重懸細胞，制成5×10⁵/ml單細胞懸液；

{3}將單細胞懸液接種至10cm細胞培養皿中，細胞生長3天融合度達到90％后，加含0.5mmedta的dpbs消化，使用培養基k重懸細胞，制成5×10⁵單細胞懸液，備用；

步驟五：含有附屬器的組織工程雙層皮膚的構建

<i>將羊膜打孔成與6板孔直徑相同的羊膜圓片；

<ii>將成纖維細胞與毛囊細胞按1.0:1的比例混合，成纖維細胞與毛囊細胞接種總密度為1×10⁷/ml，接種到羊膜基質層，加入培養液i進行培養，待細胞的融合度達到80％，在羊膜的上皮面接種表皮細胞，接種密度為1.5×10⁶/ml，加入培養基g進行培養；

<iii>培養2天后表皮細胞緊貼于羊膜上皮面，將培養基g棄去，加入2ml培養液l繼續培養，每天換液，培養2天，即得。

所述的dmem/f12培養液體積比為9:1，

所述的羊膜為脫細胞羊膜，使用前浸泡在含有1％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時。

實施例3一種含附屬器的組織工程皮膚

與實施例2的區別是，使用的羊膜為脫細胞羊膜，使用前浸泡在含有0.5％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時；

步驟五，含有附屬器的組織工程雙層皮膚的構建，具體如下：

<i>將羊膜打孔成6板孔直徑相同的羊膜圓片；

<ii>將成纖維細胞與毛囊細胞按1.1:1的比例混合，接種到羊膜基質層，接種總密度為2×10⁷/ml，加入培養液i進行培養，待細胞的融合度達到75％，在羊膜的上皮面接種表皮細胞，加入培養基g進行培養，接種密度為2×10⁶/ml；

<iii>培養2天后表皮細胞緊貼于羊膜上皮面，將培養基棄去，加入2ml培養液l繼續培養，每天換液，培養2天，即得；其他同實施例2。

實施例4一種含附屬器的組織工程皮膚

與實施例2的區別是，使用的羊膜為脫細胞羊膜，使用前浸泡在含有2％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時；

步驟五，含有附屬器的組織工程雙層皮膚的構建，具體如下：

<i>將羊膜打孔成與培養板孔直徑相同的羊膜圓片；

<ii>將成纖維細胞與毛囊細胞按0.9:1的比例混合，接種到羊膜基質層，接種總密度為0.2×10⁷/ml，加入培養液i進行培養，待細胞的融合度達到85％，在羊膜的上皮面接種表皮細胞，加入培養基g進行培養，接種密度為1×10⁶/ml；

<iii>培養2天后表皮細胞緊貼于羊膜上皮面，將培養基棄去，加入2ml培養液l繼續培養，每天換液，培養2天，即得；

其他同實施例2。

對比例1培養基成分與種類

與實施例1的區別是，培養基i不添加羧甲基殼聚糖，其他同實施例1。

對比例2一種含附屬器的組織工程皮膚

與實施例2的區別是，所涉及到的培養基成分如對比例1，所述的組織工程皮膚制備方法與實施例2類似。

對比例3一種含附屬器的組織工程皮膚

與實施例2的區別是，使用的羊膜為脫細胞羊膜，使用前沒有浸泡含有1％質量分數殼聚糖的deme培養基中12小時，其他同實施例2。

試驗例1、細胞的鑒定

通過對實施例2-4進行細胞鑒定，發現本發明實施例2-4制得的組織工程皮膚細胞種類與分布類似，其中以實施例2為例進行具體細胞的鑒定。

(1)表皮細胞的鑒定

表皮細胞的表型鑒定免疫熒光鑒定

①0.25％胰酶消化表皮細胞，以1×10⁵的接種量接種于12孔板中，待其貼壁，4％的多聚甲醛固定2h，pbs洗三遍；

②加200μl的一抗稀釋液(pbs+10％血清+0.3％tritonx-100)常溫封閉1-2h；

③棄去一抗稀釋液，加入200μl鼠源ck19一抗抗體(稀釋度為1:100)，4℃孵育過夜，pbs沖洗3次，每次5min；

④加200μlfitc標記羊抗鼠二抗(1：400)，常溫避光反應1h，pbs沖洗；上機檢測前用pi染核；

⑤結果判定：熒光倒置顯微鏡下觀察結果見綠色熒光為陽性，ck19表達于細胞漿，與同表達于細胞核的pi顯示的紅色熒光疊加后為橙色熒光。結果見附圖1。

本發明細胞顯示綠色熒光為表皮細胞標志分子ck19在細胞質中的表達，ck19是細胞早期分化過程表達的角蛋白，從圖1中可以看出，本發明細胞質顯示為綠色熒光，為陽性，檢測細胞為表皮細胞，

流式細胞學鑒定

①0.25％胰酶消化表皮細胞并收集細胞，細胞數為2×10⁵個；

②細胞胞重懸于1mldpbs中洗滌2次，200r/min，離心5min，得到的細胞沉淀加入1ml70％預冷的酒精重懸固定2h；

②離心棄去固定液，加入200μl鼠源ck19、一抗抗體(稀釋度為1:100)常溫下孵育30min；

④1mlpb洗滌后，分別與fitc標記二抗(稀釋度為1:200)常溫避光孵育1h；

⑤pbs洗兩次后，棄去pbs，根據細胞量加入適量的pbs重懸細胞，利用流式細胞儀檢測。結果見附圖2。

從圖2中可以看出，所檢測的細胞ck19陽性表達率為95％以上，因此同樣得出檢測細胞為表皮細胞。

(2)成纖維細胞的鑒定

免疫熒光鑒定

①0.25％胰酶消化成纖維細胞，以1×10⁵的接種量接種于12孔板中，待其貼壁，4％的多聚甲醛固定2h，pbs洗三遍；

②加200μl的一抗稀釋液(pbs+10％血清+0.3％tritonx-100)常溫封閉1-2h；

③棄去一抗稀釋液，加入200μl鼠源vimentin一抗抗體(稀釋濃度為1:100)，4℃孵育過夜，pbs沖洗三次3次，每次5min；

④加200μlfitc標記羊抗鼠二抗(1：400)，常溫避光反應1h，pbs沖洗；上機檢測前用pi染核；

⑤結果判定：熒光下觀察見綠色熒光為陽性。結果見附圖3。

圖3顯示本發明細胞顯示綠色熒光，為成纖維細胞標志分子vimentin，說明了本發明呈陽性，所檢測細胞為成纖維細胞。

rt-pcr檢測成纖維細胞分子標志物vimentinmrna水平的表達

vimentin引物序列為(f5'-gaacgccagatgcgtgaaatg-3'，r5'-ccagagggagtgaatccagatta-3'，280bp)，β-actin引物序列(f5'-ttgcgttacaccctttctt-3'，r5'-caccttcaccgttccagt-3'，497bp)(1)細胞總rna提取

①0.25％胰酶消化成纖維細胞收集細胞，移入1.5ml離心管中，離心棄上清液；

②加入1mltrizol裂解細胞，充分振蕩混勻室溫靜置5min，然后加入200μl的氯仿，上下振蕩混勻，室溫靜置15min；

③4℃條件下，12000r/min離心15min；取上層水相，加入500μl異丙醇，振蕩混勻，室溫靜置10min；

④4℃條件下，12000r/min離心10min；棄上清，1ml75％的乙醇洗滌沉淀，懸浮后4℃條件下，12000r/min離心5min；棄上清，將沉淀室溫干燥2～5min，溶于depc水中。

(rna的質量鑒定：利用紫外分光光度計測定提取的細胞rna純度及含量，a260與a280比值在1.8～2.0之間，基本無蛋白質污染。)

(2)總rna逆轉錄反應合成cdna

①反應體系

300ng樣品rna，50pmol通用引物，無rna酶水至7μl，2μl5×mlvpcr緩沖液，5μmol脫氧核糖核苷三磷酸混合物，10urna酶抑制劑，50u逆轉錄酶，total10μl。

②反應條件

引物與模板結合：70℃10min，

轉錄工作：42℃1h，

解鏈：70℃15min，

降溫：4℃5min。

rt-pcr反應體系及條件

①反應體系

滅菌蒸餾水7.7μl、taq酶10μl、上游引物1pmol、下游引物1pmol、cdna1.5μl、total20μl。

②反應條件

③反應結束后，取pcr產物5μl，經3％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察，集rt-pcr凝膠圖像并進行分析。結果見附圖4。

從圖4中可以看出，β-actin作為內參，得出vimentin得以表達，并且屬于高表達，說明了檢測的細胞中vimentin屬于高表達蛋白，證明檢測細胞屬于成纖維細胞。

(3)毛囊細胞的鑒定

免疫熒光鑒定

所用抗體為兔源ck15抗體，實驗步驟同成纖維細胞免疫熒光鑒定步驟，結果見附圖5。

ck15集中表達于毛囊隆突區，是毛囊細胞的標志分子，圖5顯示綠色熒光為ck15，說明本發明檢測的細胞為陽性，證明檢測的細胞為毛囊細胞。

pcr鑒定

ck15引物序列(f5'-ctacagccctacatacac-3'，r5'-ggtctgtgctgcagctca-3'，560bp)；其他實驗步驟同成纖維細胞檢測步驟。結果見附圖6，從圖6中可以看出，pcr產物電泳成像得到單一的ck15條帶，說明了檢測的細胞為毛囊細胞。

(4)組織工程皮膚形態分析

將實施例2得到的雙層組織工程皮膚進行檢測，將其放入he染色劑中，通過he染色后并在鏡下呈現細胞的圖像，結果見附圖7。

從圖7中可以看出，不同類型的細胞形態結構存在很大的差異，其中表皮細胞位于皮膚最外層，圖7中可以看出胞質中含有大量的透明角質顆粒，屬于表皮細胞分泌物質角蛋白，成纖維細胞呈現細長形態，位于表皮細胞內部，毛囊細胞分布在皮膚的最內層，本發明制備的組織工程皮膚與人體皮膚結構近似，含有的毛囊結構可以有效地增加皮膚的透氣性，更加有利于皮膚創口愈合。

試驗例2、組織工程皮膚性質評價

實施例2-4與對比例2-3：顯微鏡觀察組織工程皮膚發現，放大同樣倍數時，觀察細胞種類與生長密度，以實施例2為參照進行比較，具體見表1所示。

表1細胞種類與生長密度

顯微鏡觀察組織工程皮膚發現實施例2-4與對比例2-3中的細胞種類位置更加有序，實施例2-4細胞種類與生長密度相似，細胞密度高，而對比例2-3細胞中表皮細胞數、成纖維細胞與毛囊細胞生長無序，密度低。

試驗例2、愈合效果分析

試驗材料：雄性balb/c-nu小鼠，于小鼠背部正中線上，用手術剪去除一直徑為6mm的圓形皮膚全層，移植實施例2-4與對比例2-3制備的組織工程皮膚。

實施例2-4組織工程皮膚與創面貼敷效果較好，1周后創面面積愈合70％左右，新生皮膚與正常皮膚觸感相同。

對比例2-3組織工程皮膚與創面貼敷效果較好，1周后創面面積愈合60％左右，新生皮膚對比正常皮膚觸感稍感緊繃。對比發現本發明實施例1-3相對對比例2-3具有愈合效果更好，愈合速度快。