本發明屬于分子生物學領域，特別涉及一種探針組和試劑盒，通過使用熒光原位雜交的手段，快速檢測樣品中的alk基因斷裂。

背景技術：

肺癌是中國乃至全球致死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)是最常見的亞型，約占肺癌發病率的85％。近年來，隨著對nsclc分子生物學特征的深入研究，晚期nsclc已逐漸進入到靶向驅動基因指導的個體化治療時代。特別是針對alk基因斷裂陽性的nsclc分子亞型。間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，alk)基因斷裂陽性是nsclc的一個特定分子亞型，約占nsclc的5％左右。alk是一種受體酪氨酸激酶，為胰島素受體(ir)超家族成員。alk主要表達于發育中的中樞和外周神經系統，在成人中的正常肺等組織中不表達，說明alk對神經系統的正常發育和功能發揮了作用。雖然alk的正常生理功能尚未完全闡明，但是當其與其它基因發生融合重排表達，則具有高度的致癌性。克唑替尼等藥物可以對alk斷裂引發的nsclc進行特異性的靶向治療。

由于上述原因，alk基因斷裂被列入nsclc臨床必檢項目，目前臨床上檢測alk基因斷裂的常見方法有免疫組化(ihc)和熒光原位雜交(fish)，其中fish是檢測alk基因斷裂的金標準。但傳統fish使用的是基因組探針，探針總長度達100kb以上，由于探針長度極長，覆蓋范圍極大，使得部分序列不可避免地出現非特異性雜交，導致背景偏高；同時，過長的探針也經常導致熒光信號點發散，不利于信號的確認和統計。由于傳統fish探針單位長度的熒光強度有限，用減少探針長度的方法來解決上述問題，會使得熒光信號強度降低，不利于檢測。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種探針組，通過熒光原位雜交的手段，建立一種快速、靈敏、特異性地檢測樣品中alk基因斷裂的方法。

本發明的快速檢測alk基因斷裂的方法與傳統fish方法相比，具有背景低，信號點集中，特異性強，速度快等優點，能快速、高效地檢測alk基因斷裂。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供了一種快速檢測alk基因斷裂的探針組，所述探針組由接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針組成，所述接觸探針包括接觸探針1和接觸探針2，所述擴增探針包括擴增探針1和擴增探針2，所述熒光探針包括熒光探針1和熒光探針2，其中，接觸探針1、擴增探針1、熒光探針1、接觸探針2、擴增探針2和熒光探針2的堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tagttggtaaggtaacggcttaccaaggca(gtatjcgcjctgftatjccg)-3’；

擴增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)-3’；

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’；

接觸探針2：

5’-aggcgactttctggtctgtaactgacgctg(agtfajcgcfgtafcaajtj)-3’；

擴增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)-3’；

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’。

優選地，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團標記。

優選地，所述熒光基團為cy3、fitc或fam。

進一步地，所述接觸探針1、所述擴增探針1和所述熒光探針1用于檢測alk基因斷裂位點n端，所述熒光探針1將alk基因斷裂位點n端標記為紅色熒光，所述接觸探針2、所述擴增探針2和所述熒光探針2用于檢測alk基因斷裂位點c端，所述熒光探針2將alk基因斷裂位點n端標記為綠色熒光，所述接觸探針、所述擴增探針和所述熒光探針的堿基序列中的f表示甲基化的c，j表示甲基化的g，引入f/j兩種天然基因組dna中不存在的堿基，可以有效地減少非特異性雜交，提高檢測的特異性。

本發明還提供了一種用于快速檢測alk基因斷裂的試劑盒，所述試劑盒包括雜交液和上述由接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針組成的探針組。

進一步地，所述雜交液包括：1～10％(w/v)硫酸葡聚糖，100～1000mmnacl，10～40％(v/v)去離子甲酰胺，5mmna2edta，0.01～1％(v/v)tritonx-100，5～200mmtris-hcl(ph7.5)，0.1～1％的吐溫80，0.1～1％的三甲銨乙內酯。

本發明最后提供了一種上述試劑盒快速檢測alk基因斷裂的方法，包括如下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴增探針1、擴增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區域，蓋片，膠水封邊，置于雜交儀中雜交30min；

(5)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動1～2次，在暗處自然晾干；

(6)將10μldapi復染劑滴于載玻片的雜交區域，加蓋蓋玻片，靜置10min，用熒光顯微鏡鏡檢。

本發明的技術要點或原理：熒光原位雜交(flourescenceinsituhybridization，fish)是一種應用標記有熒光物質的探針，通過雜交的方法來檢測細胞或組織內特異性dna或rna的方法；傳統的熒光原位雜交由于單條探針的熒光強度有限，只能通過用多條探針共同作用的方法來提高熒光信號強度，這些探針單條長度約200～500bp，覆蓋總計高達100kb以上的基因組區域。由于探針數量多，覆蓋范圍廣，不可避免的有部分探針會產生非特異性雜交，從而導致背景上升。同時，由于探針的覆蓋范圍過大，很多時候熒光信號不能精確地聚成一個點，而是會發散開來，影響檢測和結果判讀，此外，傳統fish檢測需經歷長達16小時的雜交，檢測時間長，檢測效率低。

本發明通過引入接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針，并通過這三種探針與靶基因(alk)的相互作用，將熒光信號放大400倍，且雜交時間僅需要30分鐘；本發明通過在三種探針中引入f(甲基化的c)和j(甲基化的g)兩種天然dna中不存在的堿基，來提高三種探針相互作用的精度，有效地避免非特異性雜交。

本發明通過大量實驗，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標的最佳濃度為10ng/l。

本發明熒光探針5’端的熒光基團，包括但不限于cy3、fitc或fam等，可以根據現有技術進行添加。

與傳統熒光原位雜交方法相比，本發明提供的方法具有以下優點：

1、本發明的探針組特異性地識別alk基因斷裂位點n、c兩端30bp的序列，只有傳統方法的千分之一，由于探針覆蓋區域小，產生非特異性擴增的概率大大降低，從而背景更干凈；

2、本發明的探針組長度只有傳統fish方法的千分之一，由于探針覆蓋區域小，產生的熒光信號更加集中，同時，由于熒光信號被放大了400倍，熒光信號比傳統方法更易識別和檢測；

3、本發明的探針組的相互作用dna區段均在30bp以下，只需要30分鐘就能完成雜交，比傳統fish方法(16小時)的雜交時間大為縮短。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它附圖。

圖1為使用探針檢測alk基因斷裂的熒光圖，其中a為使用傳統fish探針檢測alk基因斷裂的陰性結果，b為使用本發明的探針組檢測alk基因斷裂的陰性結果，c為使用傳統fish探針檢測alk基因斷裂的陽性結果，d為使用本發明的探針組檢測alk基因斷裂的陽性結果。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1：接觸探針、擴增探針和熒光探針三種探針的設計和合成

(1)通過序列比對和高級結構分析，選取alk基因斷裂位點兩端各30bp的序列分別作為檢測靶位點1和檢測靶位點2，其堿基序列分別為：

靶位點1：5’-tgccttggtaagccgttaccttaccaacta-3’

靶位點2：5’-cagcgtcagttacagaccagaaagtcgcct-3’

(2)根據靶位點序列，設計互補的探針序列，并在其3’端添加20組20堿基的重復序列，構成接觸探針1和接觸探針2，其堿基序列分別為：

接觸探針1：

5’-tagttggtaaggtaacggcttaccaaggca(gtatjcgcjctgftatjccg)20-3’

接觸探針2：

5’-aggcgactttctggtctgtaactgacgctg(agtfajcgcfgtafcaajtj)20-3’

重復序列經dna序列比對，和人類基因組上任何區段不匹配，不會產生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進一步降低非特異性信號產生的可能性；

(3)根據各自接觸探針的重復序列，設計相應的擴增探針1和擴增探針2，其堿基序列分別為：

擴增探針1：

5’-cggfatajcagfgcgfatac(tcfacgjcfctajggafaafg)20-3’

擴增探針2：

5’-fafttgjtacjgcgftjact(gcafjttaccgfajjtacft)20-3’

擴增探針的3’端也帶有20組20堿基的重復序列，經經dna序列比對，和人類基因組上任何區段不匹配，不會產生非特異性雜交，并且通過引入非天然的堿基f和j，進一步降低非特異性信號產生的可能性；

(4)設計相應的熒光探針1和熒光探針2，其堿基序列分別為：

熒光探針1：5’-cy3-jttjtccftagjgfcgtjga-3’

熒光探針2：5’-fitc-ajgtafftjcggtaafjtgc-3’

在本實施例中，所述熒光探針1和所述熒光探針2的5’端用熒光基團標記。所述熒光基團包括但不限于fitc、fam或cy3等，可以根據現有技術進行添加。

(5)人工設計合成相應的分子信標

在本實施例中，通過對分子信標做熱變性曲線實驗，確定熒光原位雜交的最佳溫度為42-58℃，甲酰胺最佳濃度為10-40％，分子信標最佳濃度為10ng/l。

實施例2：傳統fish探針和本發明的探針組檢測alk基因斷裂

a、傳統fish探針檢測

使用傳統fish探針檢測alk基因斷裂的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)吸取3μl探針加入到7μl雜交緩沖液中，輕彈離心管底部混勻后短暫離心，得到探針混合物；

(4)將10μl探針混合物滴于載玻片的雜交區域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交16h；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動載玻片1～2次；

(7)在室溫下將載玻片浸入含0.1％(v/v)np-40的2×ssc溶液中漂洗30s，其間晃動載玻片1～2次；

(8)在室溫下將載玻片依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，然后在暗處自然晾干；

(9)在載玻片的雜交區域中滴加10μldapi復染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產生氣泡。靜置10分鐘，用熒光顯微鏡鏡檢。

b、本發明的探針檢測

使用本發明的探針組檢測alk基因斷裂的方法，包括以下步驟：

(1)吸取10μl樣本滴在載玻片上，在56℃下烘干，使樣本固定在載玻片上；

(2)在室溫下將載玻片浸入二甲苯中脫蠟2次，每次10min，隨后在100％乙醇中浸泡5min，接著依次浸入100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各2min復水，在90℃下浸入純化水中煮20-30min，每5min將載玻片取出觀察一次，防止樣本脫落，取出載玻片，在室溫下將其依次浸入70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2min脫水，自然晾干；

(3)分別吸取0.5μl的接觸探針1、接觸探針2、擴增探針1、擴增探針2、熒光探針1和熒光探針2，加入到17μl雜交緩沖液中，混勻，離心，得到探針混合物；

(4)將20μl探針混合物滴于載玻片的雜交區域，立即加蓋玻片，封片膠封住蓋玻片邊緣，避免蓋玻片與玻片之間產生氣泡；

(5)將載玻片置于雜交儀中，在變性溫度為83℃，變性時間為5min，雜交溫度為42℃的條件下雜交30min；

(6)去除載玻片上的封片膠和蓋玻片，在67±1℃下干燥2h，然后將其浸入含0.3％(v/v)np-40的0.4×ssc溶液中漂洗2min，其間晃動1～2次，并在暗處自然晾干；

(7)在載玻片的雜交區域中滴加10μldapi復染劑，加蓋蓋玻片，避免蓋玻片與載玻片之間產生氣泡，靜置10分鐘，用熒光顯微鏡鏡檢。若該樣本為正常細胞，則可看到兩個黃色信號，或緊挨在一起的紅色、綠色熒光信號，若該樣本為發生alk基因斷裂的細胞，則會有分散開來的紅色、綠色熒光信號。

(8)計算每個基因紅、綠色熒光強度比值(ratio值)：隨機選取熒光顯微鏡內觀察的30個細胞，統計30個細胞的細胞核中的紅信號總數和綠信號總數，按照下列公式計算：

ratio值＝30個細胞核中紅信號總數/30個細胞核中綠信號總數。

(9)根據計算的ratio值判斷檢測結果：

若ratio值<2，則該樣本為陰性結果，說明該樣本無alk基因斷裂；若ratio值>2，則該樣本為陽性結果，說明該樣本存在alk基因斷裂。

c、兩種方法的結果分析

經檢驗，本發明提供的fish方法與傳統fish方法相比，對樣本陰陽性判斷的一致性超過99.9％，但傳統fish方法需要雜交16小時，本發明的fish方法只需雜交30分鐘。且本發明的fish方法背景更干凈，熒光信號更清晰，如圖1所示。

最后所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。