本發明屬于基因檢測及分子遺傳學領域，具體涉及一種用于檢測融合基因的雙鏈探針的制備方法。
背景技術：
：融合基因檢測對很多癌癥的診斷和治療具有重要意義，目前融合基因檢測的主要方法有熒光原位雜交和實時定量聚合酶鏈式反應(qpcr)。熒光原位雜交是融合基因檢測的金標準，優點在于準確，但對于低頻率融合容易漏檢，操作復雜，對操作人員要求較高，只能確定大概融合位點不能定位到位點的具體序列。qpcr檢測從rna水平檢測融合基因，靈敏度高，成本低，周期短，但只能檢測已知確定有融合序列的融合基因類型，不能檢測未知融合類型，也不能確定融合位點序列。隨著二代測序技術的不斷發展，測序成本越來越低，在醫學領域的應用越來越廣，用于檢測融合基因的探針的制備技術，有助于二代測序在融合基因檢測中的應用。用于檢測融合基因的探針的特點在于可以確定具體的融合位點序列，主要用于檢測已知基因的已知融合基因類型，也可檢測出已知基因的未知融合基因類型。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種融合基因檢測探針的制備方法，通過該方法可快速，低成本制備出多層覆蓋，均一性好，可自由組合調整的探針，該探針可高效、準確檢測融合基因。一方面，本發明提供一種融合基因檢測探針的制備方法，其包括以下步驟：(1)根據目標基因融合位點發生的內含子和外顯子確定探針區域；(2)以探針區域為模板設計引物從基因組dna擴增探針區域；(3)對擴增的探針區域加生物親和素標記；(4)切膠回收加生物親和素標記的探針區域；(5)將加生物親和素標記的探針區域隨機打斷成60-120bp的小片段探針；(6)探針定量檢測。在一個實例中，在步驟(1)中，可根據實際情況選擇單端捕獲或雙端捕獲，其中所述單端捕獲指代捕獲參與融合的一個基因，而所述雙端捕獲指代捕獲參與融合的兩個基因。在另一個實例中，在步驟(1)中，針對融合位點出現頻繁的區域設計探針。在另一個實例中，其中，步驟(2)中的所述探針區域可為alkintron19-exon20。在另一個實例中，探針區域擴增片段的長度可為1k-8k。在另一個實例中，其中，步驟(3)可以包括以步驟(2)中得到的產物為模板，使用生物親和素-dutp，通過pcr方法，對擴增的探針區域加生物親和素標記。在另一個實例中，在步驟(4)和(5)之間，還可以包括將加生物親和素標記的探針區域按分子比等比例混合的步驟。在另一個實例中，在隨機打斷之后不再有任何篩選、擴增。另一方面，本發明提供一種根據上述方法制備的探針。再一方面，本發明提供所述探針用于檢測融合基因的用途。又一方面，本發明提供一種檢測融合基因的方法，其中，使用上述方法制備的探針進行檢測。有益效果根據本發明的方法，可快速低成本地制備出可高效準確檢測融合基因的多層覆蓋，均一性好，可自由組合調整的探針。附圖說明圖1為根據本發明的方法制備探針的原理流程圖。圖2為根據本發明的方法打斷后探針大小分布圖。圖3為經過人eml4-alk融合基因檢測試劑盒(cat:rh001，購自雅康博生物)qpcr驗證為alk陽性的商業樣本，用本發明的方法制備的探針的檢測結果序列示意圖。圖4為對于自制0.5％alk陽性樣本，用本發明的方法制備的探針的檢測結果序列示意圖。圖5顯示根據本申請的實施例制備的探針對目標區域覆蓋的均一性。具體實施方式為了便于了解本發明，下面將本發明進行更全面的描述。本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如josephsambrook等人所著，《分子克隆實驗指南(第三版)》中所述的條件，或按制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種化學試劑，均為市售產品。實施例：用于檢測alk融合基因的液相雜交捕獲探針的制備1.針對alk基因高頻融合區域(intron19-exon20)設計擴增引物(參考文獻“tyrosinekinasegenerearrangementsinepithelialmalignancies”,alicet.shaw等人，natrevcancer,2013年11月)。表1.alk融合基因融合位點區域2.探針區域擴增具體方法如下：pcr反應體系：底物dna(50ng/μl)，1μl；正向引物(見上表1，10μm)，1μl；反向引物(見上表1，10μm)，1μl；mgcl2(25mm)，4μl；dntpmixture(各2.5mm)，4μl；10xlapcr緩沖液ⅱ(無mg2+)，5μl；takaralataq(5u/μl，購自takara)，0.5μl；h2o，33.5μl；總體積50μl。擴增條件：94℃，5分鐘；(94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s)30個循環；72℃，5分鐘。pcr產物進行電泳初步確定為目的條帶后送樣測序，測序結果顯示為探針區域后，剩余pcr產物可用于下列操作：克隆到載體上作為后續探針制備模板永久保存使用，具體方法詳見分子克隆試驗指南(可選做)。3.探針區域加生物親和素標記pcr反應體系：底物為步驟2中得到的pcr產物，2μl；正向引物(見上表1，10μm)，2μl；反向引物(見上表1，10μm)，2μl；mgcl2(25mm)，4μl；datp(2.5mm)，1μl；dgtp(2.5mm)，1μl；dctp(2.5mm)，1μl；生物親和素標記的dutp(1mm，購自thermoscientifictm)，2.5μl；10xlapcr緩沖液ⅱ(無mg2+)，5μl；takaralataq(5u/μl，購自takara)，0.5μl；h2o，29μl；總體積50μl。擴增條件：94℃，5分鐘；(94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s)30個循環；72℃，5分鐘。4.將加生物親和素標記后的探針區域用切膠回收試劑盒(cat.no.28704，qiagen)切膠純化。5(可選).將生物親和素標記的探針區域混合將純化后帶有生物親和素標記的探針稀釋到20ng/μl，共50μl。如果有多個探針區域可按分子比等比例混合，如以下表2中所示。表2.多個探針區域按分子比等比例混合由于該步驟涉及較多探針區域，以上僅通過表2列出多個探針區域可按分子比混合的示例性方法。6.生物親和素標記的探針區域片段化通過物理打斷使探針片段化。根據需要選擇適宜片段長度。以60-120bp探針為例，使用打斷儀(covaris)，打斷條件如以下表3中所示。表3.打斷條件管50μl目標bp(峰)200最高入射功率(w)175工作系數10％cyclesperburst200處理時間(s)15007.定量質檢采用qubit熒光計對探針進行定量，定量結果為15ng/μl左右。之后，采用安捷倫2100生物芯片分析儀或電泳檢測探針長度，具體結果請參見圖2。通過羅氏雜交試劑盒檢測探針效果(注：本發發明制備的探針為雙鏈探針，使用前95℃變性10分鐘，其余操作同羅氏)。具體方法詳見seqcapezlibrary雜交說明書(nimblegen)。結果說明在以下表4中說明根據上述方法制備的探針的捕獲效果。表4.探針捕獲效果探針區域大小覆蓋度數據量有效數據量平均深度25334bp100％2.57m28.73％391153771bp100％3.83g29.36％13159本發明制備的探針，即使探針捕獲區域較小也可以得到將近30％的有效數據量。與大規模合成的探針庫相比，本發明探針制備方法更靈活，更適用于針對融合基因的長片段區域探針制備。在以下表5中顯示根據本發明的方法制備的探針的融合基因檢測效果。表5.融合基因檢測效果*自制alk0.5％陽性樣本：在alkintron19和eml4intron13區域設計并合成500bp的融合基因片段，將此片段定量后按分子比0.5％的比例混入正常基因組dna中，制備成自制alk0.5％陽性樣本。*自制陰性樣本：未加入上述融合基因片段的正常基因組dna文庫為自制陰性樣本。本發明制備的融合基因檢測探針，采用單端捕獲技術，包含alk在內的主要癌癥相關融合基因，總區域50k左右，3g數據量平均深度可達10000x。因此，本發明探針可高效捕獲目標區域，結果準確，可確定到融合位點。商業樣本檢測結果與qpcr相符(圖3)；自制0.5％alk陽性樣本檢測出融合序列，并與加入的陽性片段序列相符(圖4)。另外，圖5顯示根據本發明的制備方法制備的alk探針，雜交捕獲目標區域覆蓋的均一性良好。綜上所述，本發明針對融合基因在基因組上隨機斷裂的特點，設計多層覆蓋探針制備方法，該方法制備的探針可在dna水平高效檢測融合基因。sequencelisting<110>大連晶泰生物技術有限公司<120>一種用于檢測融合基因的雙鏈探針的制備方法及通過該方法制備的探針<130>di17-0731-xc03<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>正向引物<400>1tgcagtcactgtgaggtagacg22<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>反向引物<400>2ttgggtcgttgggcattccg20當前第1頁12