本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法，以及在該方法中應(yīng)用的漆酶基因。
背景技術(shù)：
：丹參(salviamiltiorrhizabunge)是一種重要的中藥材，包含多種有效成分。其中，丹酚酸b是研究得較多的一種，具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)等多種藥理作用。目前，丹酚酸b的獲得主要依賴于從丹參的干燥根中提取。然而，自然狀態(tài)下丹參根部的丹酚酸b含量較低，使得丹參根部提取物中的丹酚酸b含量也不夠理想，影響了其藥用價值。研究表明，丹參體內(nèi)酚酸類化合物共用同一個生物途徑。在丹酚酸b的生物合成過程(生物合成過程參見附圖1)中，迷迭香酸(ra)是丹酚酸b(sab)的直接前體，并且該轉(zhuǎn)化過程關(guān)系到丹參中sab的最終含量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明人在發(fā)現(xiàn)前述sab生物合成過程的基礎(chǔ)上進行了體外酶轉(zhuǎn)化試驗，發(fā)現(xiàn)漆酶能夠?qū)a轉(zhuǎn)化為sab。發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)，丹參體內(nèi)有多種疑似漆酶的基因，但其中僅有少數(shù)對sab的含量具有影響。基于上述發(fā)現(xiàn)，為了提高丹參體內(nèi)，尤其是丹參毛狀根內(nèi)的丹酚酸b含量，發(fā)明人提出了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法，其特征在于，通過在丹參毛狀根中過表達丹參漆酶smlac7基因或丹參漆酶smlac20基因從而得到丹酚酸b含量提高的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根，包括如下步驟：步驟s1，構(gòu)建含有丹參漆酶smlac7基因或含有丹參漆酶smlac20基因的過表達載體；步驟s2，將步驟s1得到的過表達載體轉(zhuǎn)染入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌；步驟s3，用步驟s2得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化丹參組織并誘導(dǎo)發(fā)根，獲得轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根，其中，丹參漆酶smlac7基因的序列如seqidno：1所示，丹參漆酶smlac20基因的序列如seqidno：2所示。本發(fā)明提供的提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法，還可以具有這樣的技術(shù)特征，其中，過表達載體為含有丹參漆酶smlac7基因的過表達載體，其序列如seqidno：4所示。本發(fā)明提供的提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法，還可以具有這樣的技術(shù)特征，其中，過表達載體為含有丹參漆酶smlac20基因的過表達載體，其序列如seqidno：5所示。進一步，本發(fā)明還提供了一種用于提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的丹參漆酶基因序列，其特征在于：其中，丹參漆酶基因序列為丹參漆酶smlac7基因序列，其序列如seqidno：1所示。進一步，本發(fā)明還提供了一種用于提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的過表達載體，其特征在于：其中，過表達載體含有丹參漆酶smlac7基因序列，該過表達載體的基因序列如seqidno：4所示。進一步，本發(fā)明還提供了一種用于提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的丹參漆酶基因序列，其特征在于：其中，丹參漆酶基因序列為丹參漆酶smlac20基因，其序列如seqidno：2所示。進一步，本發(fā)明還提供了一種用于提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的過表達載體，其特征在于：其中，過表達載體含有丹參漆酶smlac20基因序列，該過表達載體的基因序列如seqidno：5所示。發(fā)明作用與效果根據(jù)本發(fā)明的提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法及漆酶基因，將丹參中的漆酶基因smlac7或smlac20與載體連接并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入丹參并誘導(dǎo)，就能夠得到丹酚酸b含量提高的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根，提升丹參的藥用價值。具體實施方式以下結(jié)合實施例來說明本發(fā)明的具體實施方式。在下述各實施例中，所采用的試劑、酶及試劑盒如無特殊說明均從一般商業(yè)途徑獲得，未注明的實驗條件均參照常規(guī)實驗條件或遵照供應(yīng)商的建議條件。另外，以下實施例所采用的無菌丹參苗由丹參種子培育而得，該丹參種子的來源為發(fā)明人所在課題組從陜西商洛天士力gmp種植基地購買自行保存的紫花丹參。實施例1：漆酶基因序列的擴增本實施例的目的是從丹參中獲得疑似漆酶基因的基因片段，并進行擴增，得到擴增后的相關(guān)基因片段以備轉(zhuǎn)化，包括如下步驟：步驟1-1，從丹參中提取總rna，其操作方法參考transgene的transzolupplusrnakit總rna提取試劑的使用手冊，包括如下子步驟：步驟1-1-1，將在培養(yǎng)室中生長10周的無菌丹參苗在超凈臺中剪下葉片，保存液氮中；步驟1-1-2，在葉片中加入液氮快速研磨成細粉狀，立即將粉末分裝于預(yù)先加入trnzol-up的eppendorf管中，每50mg-100mg葉片使用1mltrnzol-up；步驟1-1-3，用勻漿儀混勻，室溫靜置5min，加入0.2ml氯仿4℃10,000×g離心15min，混合液將分為三層，將上層無色水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積(約600μl)乙醇，輕輕混勻；步驟1-1-4，將得到的溶液和沉淀一起加入到離心柱中，室溫1200×g離心30sec，棄去流出液(若液體大于0.8ml，則分幾次離心)；步驟1-1-5，向離心柱中加入0.5mlcb9，室溫1200×g離心30sec，棄掉流出液，并重復(fù)該操作一次；步驟1-1-6，向離心柱中加入0.5mlwb9(使用前需要加入無水乙醇)，室溫1200×g離心30sec，棄掉流出液，并重復(fù)該操作一次；步驟1-1-7，室溫1200×g離心2min，在室溫靜置2min，徹底除去柱子中殘留的乙醇；步驟1-1-8，向離心柱中加入50-100μlrnase-freeh2o，放置于rnase-freetube中，室溫靜置1min；步驟1-1-9，室溫1200×g離心2min，洗脫rna，于－80℃保存。步驟1-2，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的濃度與純度，具體包括如下子步驟：步驟1-2-1，在電子天平上稱取0.25g瓊脂糖粉末于30ml1×tae中加熱溶解，使用溴化乙錠(eb)作為熒光染色劑，倒入插好孔板的制膠槽中冷卻；步驟1-2-2，將rna2.5μl，10×loadingbuffer1μl用槍頭混勻后上樣，設(shè)置電壓為140v，電泳15min；步驟1-2-3，采用凝膠成像系統(tǒng)對電泳后的凝膠進行檢測，結(jié)果可以清晰地看到三條帶(28srna、18srna、5srna)，理論上講28s條帶的亮度應(yīng)該為18s條帶亮度的1～2倍。步驟1-2-4，使用nanodrop2000超微量分光光度計直接測定rna的濃度：吸取2μlrnase-freeh2o作為背景溶液進行blank測定，然后吸取待測的rna溶液，根據(jù)波長260nm與280nm處的吸光度的比值測定總rna濃度(μg/μl)(其中，od260/od280在1.8～2.0之間為佳)。步驟1-3，以丹參總rna為模板，參照北京全式金生物有限公司transscriptfirst-strandcdnasynthesissupermix試劑盒的操作說明合成cdna，反應(yīng)體系如下表1-1所示：表1-1合成cdna的反應(yīng)體系反應(yīng)條件為42℃孵育30min、85℃加熱5min，得到的cdna保存在-80℃。步驟1-4，獲得疑似漆酶的基因，包括如下子步驟：步驟1-4-1，序列比對：將丹參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的基因序列通過與多個物種(擬南芥、小麥、白楊等)的漆酶基因進行同源性比對，再經(jīng)過序列拼接和注釋，獲得三個疑似漆酶基因的開放閱讀框(orf)序列，并設(shè)計引物序列，設(shè)計得到的引物序列見下表1-2。表1-2smlacs基因的相關(guān)引物序列表步驟1-4-2，通過rt-pcr，獲得疑似漆酶的目的基因。其中，目的基因的數(shù)量為三個，以下將該三個疑似漆酶基因分別稱為smlac7、smlac20和smlac28。rt-pcr的過程如下：取150μl離心管，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司transstartfastpfuflydnapolymerase試劑盒進行擴增，反應(yīng)體系如下表1-3所示：表1-3rt-pcr的反應(yīng)體系cdna1μlsmlacf(10μmol/l)1μlsmlacr(10μmol/l)1μldntps10μlfastpfuflybuffer5μlfastpfuflypolymerase1μlddh2o31μl總體積50μlpcr反應(yīng)條件如下：采用瓊脂糖凝膠電泳，分離并回收目的基因片段(smlac7為1689bp，smlac20為1707bp，smlac28包含三個片段，分別為750bp、751bp、529bp)。步驟1-5，將目的基因連接載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，操作方法為：將blunt-zero載體與膠回收產(chǎn)物按照1:4的比例混合在25℃放置25min。從-80℃冰箱中取出保存完好的trans1t1感受態(tài)細胞，冰浴融化；將連接產(chǎn)物加入50μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴25min；在42℃的水浴鍋中熱激90sec，迅速放入冰中靜置2min；加入500μl無抗的lb培養(yǎng)基，在37℃的搖床200rpm震蕩1h；將菌液吸到含75mg/l卡鈉霉素的lb培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器將菌液均勻展開；倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)13～15h。步驟1-6，采用pcr檢測大腸桿菌的陽性克隆，操作方法為：在8個無菌的離心管中加入1ml的lb液體培養(yǎng)基(含有75mg/l卡鈉霉素)，隨機取8個獨立的菌體于離心管中恒溫搖床震蕩，37℃、200rpm培養(yǎng)3～4h，菌液作為下一步pcr模板。反應(yīng)體系如下表1-4所示：表1-4檢測大腸桿菌陽性克隆的pcr反應(yīng)體系pcr反應(yīng)程序設(shè)定如下：pcr產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，對于含有目的片段的菌液，各取100μl送測序。測序正確的菌液活化后加入甘油于-80℃冰箱保存菌種。如上所述，經(jīng)過總rna提取、cdna合成以及rt-pcr，從丹參基因組中獲得了三個疑似漆酶的目的基因smlac7、smlac20和smlac28，其中smlac7的序列如seqidno：1所示，smlac20的序列如seqidno：2所示，smlac28的序列如seqidno：3所示。該三個目的基因具有與其他物種漆酶基因的高同源性，且各自具有相應(yīng)的開放閱讀框，能夠編碼相應(yīng)的酶蛋白，因此屬于漆酶基因。實施例2：構(gòu)建過表達載體本實施例的目的在于從實施例1中得到的含有目的基因的大腸桿菌中獲取目的基因，并將三個目的基因分別與phb-flag載體連接，構(gòu)建得到含有目的基因的過表達載體，包括以下步驟：步驟2-1，設(shè)計引物，對目的片段進行克隆。其中，pcr引物設(shè)計原則為：選取phb-flag上含有的的單克隆酶切位點且該酶切位點在基因的orf區(qū)上不存在，同時去掉目的基因的終止密碼子。設(shè)計得到的引物序列如下表2-1所示。表2-1中，斜體部分表示酶切位點。表2-1克隆目的片段所用的引物pcr反應(yīng)體系如下表2-2所示：表2-2克隆目的片段所用的pcr反應(yīng)體系含目的基因的質(zhì)粒1μlsmlacsovxf0.5μlsmlacsovxr0.5μl5buffer5μl2.5mmdntps2.5μlpcrstimulant5μlfastpfuflypolymerase1.5μlddh2o9μl總體積25μlpcr程序設(shè)置為：pcr結(jié)束后進行凝膠電泳，回收目的片段，連接bunt-zero轉(zhuǎn)化trans1-t1后涂卡那霉素抗性平板，菌檢有目的條帶者送測序。測序正確者提取質(zhì)粒保存于-20℃。步驟2-2，對目的基因質(zhì)粒和載體進行雙酶切，反應(yīng)體系如下表2-3所示：表2-3雙酶切的反應(yīng)體系phb-flag載體質(zhì)粒或目的基因質(zhì)粒30μl酶11.5μl酶21.5μlbuffer5μlddh2o12μl總體積50μl將酶切后的片段(載體切大片段，目的基因切小片段)進行凝膠電泳，并回收。步驟2-3，將目的基因質(zhì)粒和載體進行連接正向目的片段和載體酶切片段以摩爾質(zhì)量的比例為1:10進行連接，連接體系見下表2-4所示：表2-4目的片段和載體片段連接的反應(yīng)體系載體片段2μl目的片段雙酶切產(chǎn)物8μlt4連接buffer3μlt4dnaligase1μlddh2o6μl總計20μl采用上述反應(yīng)體系，25℃連接1h后，轉(zhuǎn)入trans1-t1感受態(tài)細胞，并涂卡那霉素抗性的平板。挑選陽性菌株送測序，測序正確者提取質(zhì)粒保存于-20℃冰箱，待轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。如上所述，經(jīng)過pcr、載體及目的基因雙酶切以及連接，從實施例1獲得的大腸桿菌的質(zhì)粒中得到了目的基因，并與載體連接形成了過表達載體。上述過程中，smlac7、smlac20和smlac28的pcr、酶切及連接分別獨立進行，因此最終得到的是分別含有三種目的基因的三個過表達載體。實施例3：構(gòu)建重組農(nóng)桿菌本實施例的目的是將實施例2得到的過表達載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌，包括如下步驟：步驟3-1，配制所需試劑，各試劑配方如下：lb培養(yǎng)基：酵母提取物5g，氯化鈉5g，胰蛋白胨10g溶于1l去離子水，調(diào)節(jié)ph為7；固體培養(yǎng)基每l加入7.5g植物瓊脂粉；yeb培養(yǎng)基：稱取酵母提取物、蔗糖、牛肉浸膏、蛋白胨、mgso4·7h2o0.983g，去離子水1000ml使溶解，調(diào)節(jié)ph＝7.2，若配制固體培養(yǎng)基，加入7g瓊脂即可。121℃20min高溫高壓滅菌，備用。b5培養(yǎng)基：b5粉3.21g,，mgso4·7h2o0.983g，植物瓊脂粉7.5g，蔗糖20g，高壓蒸汽滅菌，121℃，20min；卡那霉素、潮霉素溶液：去離子水溶解，過濾除菌于-20℃冰箱保存。利福平溶液：dmso溶解，過濾除菌后于-20℃冰箱保存。1/2ms培養(yǎng)基：稱取ms粉4.43g，蔗糖30g溶于1l的去離子水中，高壓蒸汽滅菌(121℃，20min)。固體培養(yǎng)基每l培養(yǎng)基加入7.5g植物瓊脂粉一起滅菌即可。步驟3-2，制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。本實施例中，采用的農(nóng)桿菌為c58c1農(nóng)桿菌，制備感受態(tài)細胞的操作流程包括如下子步驟：步驟3-2-1，將c58c1農(nóng)桿菌在1ml含有45mg/l利福平的yeb液體培養(yǎng)基活化12小時，取20μl活化好的農(nóng)桿菌在20ml上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od600達到0.5；步驟3-2-2，在4℃的低溫離心機上4000rpm離心8min；步驟3-2-3，0.1mcacl2在經(jīng)過抽濾滅菌后放置在冰上預(yù)冷，待溫度降至4℃左右，取10ml重懸菌體。冰浴半小時再離心8min，棄去上清；步驟3-2-4，加入5ml30％甘油混勻，每100μl分裝一管，于-80℃冰箱保存。步驟3-3，將過表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，包括如下子步驟：步驟3-3-1，從-80℃冰箱取出制備好的c58c1感受態(tài)細胞，放置冰上待融化后加入10μl的含有目的基因的phb-flag載體質(zhì)粒，混勻后冰浴30min；步驟3-3-2，在液氮中放置5min后，置于冰中3min，取出于37℃水浴5min.；步驟3-3-3，熱激完畢，加入600μl無抗的yeb培養(yǎng)基，28℃200rpm活化5h；步驟3-3-4，5000rpm離心8min，去掉200μl上清液后重懸菌體涂含有75mg/lkan和40mg/lrif的yeb固體平板；步驟3-3-5，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后進行菌檢，菌檢引物為phb-flag上的r端引物和目的基因上的f端引物以及phb-flag上特殊的潮霉素抗性基因hpt的兩段引物。實施例4：轉(zhuǎn)基因毛狀根培養(yǎng)與鑒定本實施例的目的在于用實施例3得到的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化丹參組織(本實施例選擇丹參葉盤作為待轉(zhuǎn)化的丹參組織)，并對其進行誘導(dǎo)發(fā)根，從而得到分別含有目的基因smlac7、smlac20和smlac28的丹參毛狀根，包括以下步驟：步驟4-1，轉(zhuǎn)化葉盤，即將重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化入丹參葉盤，包括以下子步驟：步驟4-1-1，在1.5ml的離心管中加入1ml的含有卡那霉素(75mg/l)和利福平(40mg/l)的yeb培養(yǎng)基和20μl的含有目的基因載體的菌液，在28℃恒溫搖床上200rpm過夜培養(yǎng)，空菌使用含有利福平(40mg/l)的yeb培養(yǎng)基；步驟4-1-2，從過夜培養(yǎng)的菌液中取500μl加入到25ml含有抗性的yeb培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)至od600等于0.6；步驟4-1-3，8000rpm離心10min，收集菌體，用1/2ms重懸使od600等于1.0；步驟4-1-4，剪取無菌培養(yǎng)罐中培養(yǎng)60天的丹參植株葉片，將邊緣剪掉，在ms培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)兩天后備用；步驟4-1-5，暗培養(yǎng)結(jié)束后，將的葉片用1/2ms重懸好的菌液浸泡，在28℃的恒溫搖床上培養(yǎng)10min，然后在超凈臺中用無菌的鑷子將活化好的菌液放在無菌紙上吸干多余的菌液，放置于1/2ms無抗培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2天。步驟4-2，對轉(zhuǎn)化后的丹參葉盤進行誘導(dǎo)發(fā)根和降抗處理，包括如下子步驟：步驟4-2-1，將暗培養(yǎng)兩天的轉(zhuǎn)化葉盤置于含有500mg/lcef的1/2ms培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)15天，葉盤邊緣會出1cm左右的發(fā)根；步驟4-2-2，當(dāng)發(fā)根長約5cm左右時，剪下獨立的發(fā)根置于含有cef(250mg/l)和hygr(20mg/l)的1/2ms培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，其中hygr主要用于陽性發(fā)根的篩選；步驟4-2-3，約15天后，挑出能夠在潮霉素篩選下生長良好的發(fā)根；步驟4-2-4，繼續(xù)將挑出的發(fā)根在含有cef(250mg/l)和hygr(20mg/l)的1/2ms培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，每周更換培養(yǎng)基，同時降低cef的濃度直到為0；步驟4-2-5，培養(yǎng)至發(fā)根長滿平板。步驟4-3，等量選取步驟4-2中得到的各組發(fā)根，提取dna并進行檢測，包括如下子步驟：步驟4-3-1，預(yù)先準(zhǔn)備1.5ml離心管，加入700μlgp1緩沖液，繼而加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1％，混勻后于65℃水浴預(yù)熱；步驟4-3-2，取丹參組織約100mg或干重組織約30mg，液氮中充分研磨至粉末狀。在液氮完全揮發(fā)之前，將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到第一步中準(zhǔn)備的離心管中，混勻后65℃水浴20min，期間顛倒離心管數(shù)次以混勻樣品。步驟4-3-3，加入氯仿700μl，充分混勻，12,000rpm(～13,400×g)離心5min。步驟4-3-4，將所得上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管中，下層棄之，加入700μl緩沖液gp2，用槍打勻。步驟4-3-5，將液體轉(zhuǎn)入吸附柱cb3，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，棄廢液。步驟4-3-6，加入500μl緩沖液gd，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，棄廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。步驟4-3-7，向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm(～13,400×g)離心30sec，棄廢液。步驟4-3-8，將吸附柱cb3放回收集管中，重復(fù)操作步驟7。步驟4-3-9，將吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，棄廢液。室溫靜置吸附柱cb3數(shù)分鐘，以徹底晾干殘余的漂洗液。步驟4-3-10，將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜懸空加入50～200μl洗脫緩沖液te，室溫靜置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，收集溶液。步驟4-3-11，進行瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測，其操作與步驟2-1中的rna提取與檢測的方法相同，其中od260/od280一般要求在1.6以上，dna濃度(μg/μl)的計算公式為od260×50×200(稀釋倍數(shù))×10-3。步驟4-4，對降抗后的發(fā)根進行鑒定，獲取含有目的基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。rolb、rolc基因為發(fā)根農(nóng)桿菌的特殊基因，具有誘發(fā)并維持發(fā)根形態(tài)的功能。因此，通過設(shè)計rolb、rolc基因的特異性引物進行pcr，就可以鑒定發(fā)根是否為毛狀根。另外，載體上自帶含有潮霉素抗性的基因hpt，設(shè)計該基因的特異性引物可以檢測發(fā)根是否為包含過表達載體的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。對于目的基因，采用載體上特殊的兩段引物jdpdk-f和jdpdk-1r進行pcr即可鑒別。也就是說，采用上述三種不同的引物進行pcr，即可鑒別發(fā)根是否為轉(zhuǎn)入了目的基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。其中，pcr反應(yīng)體系如下表4-1所示：表4-1發(fā)根鑒定的pcr反應(yīng)體系dna1μl正向引物0.5μl反向引物0.5μllataq5μlddh2o3μl總體積10μlpcr反應(yīng)的條件設(shè)定為：鑒定過程中所采用的各引物如表4-2所示：表4-2發(fā)根鑒定所用引物步驟4-5，將鑒定結(jié)果均為陽性(即含有目的基因)的轉(zhuǎn)基因毛狀根置于200ml的b5液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔9天換一次培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)過程中，含有smlac7及smlac20的轉(zhuǎn)基因毛狀根生長情況良好，但含有smlac28的轉(zhuǎn)基因毛狀根則生長情況差，幾乎無法得到完整的毛狀根。因此，本實施例僅得到分別含有smlac7及smlac20的兩種轉(zhuǎn)基因毛狀根。其中，含有smlac7的轉(zhuǎn)基因毛狀根共有四組，分別記為smlac7ovx-a、smlac7ovx-b、smlac7ovx-f以及smlac7ovx-g；含有smlac20的轉(zhuǎn)基因毛狀根共有四組，分別記為smlac20ovx-b、smlac20ovx-c、smlac20ovx-e以及smlac20ovx-f。實施例5：測定轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相關(guān)化合物含量本實施例的目的在于對實施例4得到的各組轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相關(guān)化合物(包括迷迭香酸和丹酚酸b)含量進行檢測，以驗證轉(zhuǎn)入目的基因提高丹酚酸b含量的效果，包括如下步驟：步驟5-1，制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液，各溶液的制備操作如下：(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密稱定丹酚酸b、迷迭香酸各2.00mg分別用甲醇定容至2ml，得混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1mg/ml。使用時，取上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液用流動相稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液，其中丹酚酸b和迷迭香酸的濃度分別是10μg/ml、4μg/ml。(2)供試品溶液將轉(zhuǎn)基因發(fā)根在40℃烘箱中干燥5小時得到干燥發(fā)根。將干燥發(fā)根用組織研磨機研磨成粉，過100目篩，取50mg，用70％甲醇超聲提取3次，每次30min(總共使用5ml甲醇)。提取完畢后，于離心機上13,500rpm離心10min，然后將上清吸取干凈，于容量瓶中定容到20ml，過濾并用流動相稀釋即得。步驟5-2，采用質(zhì)譜對丹酚酸b和迷迭香酸進行鑒定，質(zhì)譜參數(shù)如下表5-1所示：表5-1質(zhì)譜參數(shù)質(zhì)譜條件設(shè)定為：gastemp350℃；gasflow10l/min；nebulizer40psi；capillary4000v；sheathgastemp350℃；sheathgasflow10l/min。步驟5-3，采用hplc對丹酚酸b和迷迭香酸的含量進行測定，hplc條件為：儀器：安捷倫1200液相色譜串聯(lián)g6410a三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀色譜柱：watersxselectcshtmc18(2.5μm，2.1×50mm)pn.186006101ln.0101313441流動相：乙腈-(0.1％甲酸+2mmol/l醋酸銨)水溶液柱溫：35℃流動相流速：0.3ml/min進樣量：10μl單針時間：7.0min。其中，流動相的時間梯度設(shè)定如下表5-2所示：表5-2流動相的時間梯度圖2為本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因毛狀根中的相關(guān)化合物含量示意圖。圖2中，橫坐標(biāo)代表轉(zhuǎn)基因毛狀根的不同組，縱坐標(biāo)達標(biāo)相對表達量。圖中的符號“*”代表t檢驗p值大于0.01，小于0.05；“**”代表p值小于0.01。經(jīng)過上述測定過程，測得實施例4中得到的各組轉(zhuǎn)基因毛狀根中的丹酚酸b及迷迭香酸含量，結(jié)果如圖2以及表5-3、表5-4所示。其中，ck表示空白對照組(即轉(zhuǎn)入了空白載體的轉(zhuǎn)基因毛狀根)。表5-3含有smlac7的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中的迷迭香酸和丹酚酸b含量表5-4含有smlac20的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中的迷迭香酸和丹酚酸b含量上述表5-3以及表5-4中，每個表格中的數(shù)字有兩行。上一行的數(shù)字為干燥根中相關(guān)化合物的平均含量(mg/g)，下一行括號中的數(shù)字為標(biāo)準(zhǔn)差。實施例作用與效果如圖2以及表5-3、表5-4所示，將smlac7和smlac20轉(zhuǎn)入丹參后，其毛狀根內(nèi)的丹酚酸b含量均有顯著提高。雖然迷迭香酸的含量也有一定提高，但其提高倍數(shù)低于丹酚酸b的提高倍數(shù)，說明丹酚酸b提高的原因不是由于其前體化合物迷迭香酸含量提高了。也就是說，smlac7和smlac20的過表達確實有促進迷迭香酸向丹酚酸b轉(zhuǎn)化，并提高丹酚酸b的最終含量的效果。例如，實驗組smlac20ovx-b中，丹酚酸b的含量為142.21mg/g，其對照組的丹酚酸b含量則為32.14mg/g，轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹酚酸b含量提高倍數(shù)為4.4倍；同一組中，迷迭香酸的含量為12.91mg/g，對照組的迷迭香酸含量為7.24mg/g，其提高倍數(shù)為1.8倍。因此，丹酚酸b的提高倍數(shù)明顯高于迷迭香酸的提高倍數(shù)。另外，轉(zhuǎn)入了smlac28的轉(zhuǎn)基因毛狀根生長情況較差，說明該漆酶基因smlac28的過表達會影響丹參自身的生長，因而無法應(yīng)用。如上所述，將smlac7或smlac20與載體連接并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入丹參后，誘導(dǎo)得到的丹參毛狀根內(nèi)的丹酚酸b含量有顯著提高，且其含量最高可達142.21mg/g，是空白對照組含量的4.4倍。因此，本實施例提供的方法及兩種漆酶基因能夠顯著提高丹參毛狀根內(nèi)的丹酚酸b含量，提升丹參的藥用價值。sequencelisting<110>中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院<120>提高丹參毛狀根中丹酚酸b含量的方法及漆酶基因<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>1689<212>dna<213>salviamiltiorrhizabunge<400>1atgaagtttctcatcgtgtatttttcgttgctttttttcatatgtggctttgtagcagtt60catggaaagatcctaagacagagatttgtgttacaagatgccccatacacacgattgtgc120ggcagtaagagcatattaaccgtgaacggaaaatttcccgggcccaccatatatgcgaga180gtgggagacacagtaattgtggacgtcatcaacagagctagtgaaaatattactattcac240tggcatggggtgaaacagccaagaaacccatggtcagatgggccggcttacataacccag300tgcccgatccgaccgggaactaatttcagccaaagaatcgtgttgtctgatgaaatcggg360actctatggtggcacgctcacatcgaatggtttcgcgctactgtctatggtgctctcgtt420gttttacctaacttgggagatcaatatcccttccctaaacctgctgccgaaattcccatc480atattaggagaatggtggaacagtgatattagggaagttctgagggaaggccttcaaagc540ggatcggattttaatgcatctaatgctttcctcatcaatggtcaacctggagatctatat600ccttgttccaactcagatacattcaaagtgaaagtggactctggcaaaacatacctactt660cgaatgatcaacaatgtgatgaacaacatcatgttcttcaaaatcgccaaccacaacctc720accgtagtcggctccgacgccgcctacacgaagccgttcacggccgagtacgtggcaata780tctccgggccaaaccatagatgtcttgttcgtagccaaccaacaaccaagccactattac840atggcctctcggccccacaacgtcgccgggaacttcgccaacacgaccacaaccgccatc900ctcgagtacaccggaaactacacggcaccctcgtctcctctcctccccaccctccccgac960tttgcagacgaggtcgcctctgacagtttcacagcacggctgcgaagcttagcgacagag1020gctcaccccattgacgtccctcaaacagtggacaaggagcttctgtttaccctctcggta1080aacatattcgaatgcgctctaaacgagacttgcaacggaccgttgcaaggccggttcaga1140acgagcctcaacaacataacgttcgtgcagccaagaatctccattcttgatgcctattat1200aaccgtgttaacggagtctacgaggaagatttccctcagaatccgcctttcccgttcaac1260tacacgatggagttcgtgccacagctgctatggatacctcaaaatgggacagaagttaga1320gtggtggagtataatacttcagtagagcttgtcttccaaggaacaaacattcttggtggg1380acataccatcctatgcatctccatggctacagcttctatgtggtcggaagaggcaacgga1440aactttgaccgggaaagggacccttccagctataatcttgtcgatcctcctctgcagaac1500accattgcagttccaagaaacgggtggacagcgattaggttcaaggcgaataatccaggt1560gtttggcttctgcattgccatctggagcgccacgtgacctggggaatggagatggcgttc1620atcgtcagagagggaaagagccaagacgctaagatgctgcctccacctgcagacatgccc1680agatgctaa1689<210>2<211>1707<212>dna<213>salviamiltiorrhizabunge<400>2atgggatccacaaagacgacgagaatcttgcattttctagcattttttctcttagctgga60gtgatttctatccatgccaagacccatcatcaaacctttgtagtgagtgatgctccatat120agtaggctgtgtagcaacaagagcatattgactgtaaatggaaagtttcctggaccgact180gtacgtgtaactgagggtgataccattgcaattgttgttgtgaatagagcaagagaaaat240ataaccattcattggcatggagtgaagcagccgagatatccgtggtcggacgggccggaa300tatataacgcagtgcccgattcagcccggatctaattttagtcagaagattgtgctgtcg360gatgagatcgggactatgtggtggcatgcgcatagcgactggtcgcgtgctacggtgcat420ggtgcgctcatagtgtatcctcttatccagaatgattatcctttccctgtgcctgatgaa480gaagttcccatcatattaggggagtggtggaaaagtgatattcaggctgttctcactgaa540tttcttcaaactggaggagaccctaataattctgatgcatttcttataaatggacaaccg600ggtgatttgtatgaccttccatgctcaaccaaagacacgttcaagctgagtgtggaccac660gggaagagatacctaattcgaatggttaacgccgtgatgaacaccatcatgttcttcaaa720atcggcggccacaacgtcaccatcgtcggctccgacggcgcgtacctgaagcccttcacc780tccgactacatcgccatctccccgggccaaaccatcgacttcctcctcctcgccgaccaa840aaccctagccactactacatggcctctagagcctacgc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