本發明涉及生物樣本處理液，尤其是涉及一種具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液。
背景技術：
為準確診斷疾病，采用拭子采集標本（微生物、脫落的細胞或分泌物等），并對標本進行保存、培養、分離等進一步處理，是臨床醫學檢查常用的方法。
核酸樣本dna/rna降解是pcr檢測中常見問題。目前常見的樣品處理液一般為生理鹽水或pbs洗脫液，經過這些洗脫液處理后的核酸樣本保存過程中，病原體會破裂，釋放出核酸，但生理鹽水和pbs洗脫液無法抑制dnase/rnase活性，核酸很容易被降解，從而影響檢測結果的準確性。實際臨床核酸檢測中，部分標本還需要寄送到第三方檢驗中心進行檢測，運輸過程中需要維持低溫保存冷鏈運輸，代價比較高。因此標本的常溫運輸保存也是需要解決的問題。
檢測過程中還會遇到一些有生物危害性的樣本，比如呼吸道傳播疾病或接觸傳播疾病，這些樣品采集后，醫護人員在檢驗操作過程中容易帶來實驗室暴露感染。所以如何實現這些有生物危害性的樣本采集后就被滅活，以減少實驗室檢驗人員感染的風險，也是需要解決的問題。
中國發明專利《一種宮頸脫落細胞保存液》（cn200810200008.7）公開了一種保存液，包括以下組分及含量(重量)：醇類20％-50％；抗聚集試劑15％-50％；緩沖液5％-10％；離子強度維持試劑1％-20％；抗微生物試劑0.01％-0.5％；粘液溶解試劑0.1-5％；清潔劑0-0.5％。該專利的主要功能可使細胞在體外液體懸浮液環境中保持細胞形態。但是，該保存液對樣本中的rna樣本無保存效果；同時，由于細胞未被滅活，細胞中的病毒有可能在操作中傳染給檢驗操作人員。
在該技術領域，還有采用trizol保存液的，該保存液可以較好的保存rna樣本，也可通過加熱滅活病毒，但由于存在有毒揮發氣體，對操作者有危害。
除此之外，還有采用rnaseinhibitor酶類來保存rna樣本，但是成本較貴，其應用受限。
綜上所述，開發一種能夠有效實現拭子樣本的常溫保存運輸，阻止dnase/rnase降解核酸，滅活病原體，并且不影響后續檢測的拭子洗脫液，對拭子樣本的分子生物學研究和臨床上的應用非常重要，也是目前迫切需要解決的重要技術難題。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對上述現有技術存在的缺陷而提供一種具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液。
為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案：
本發明所述的具有樣本保存和滅活功能的拭子洗脫液，是由異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸、緩沖液、二硫蘇糖醇、表面活性劑、玻璃珠或聚丙烯塑料珠以及去離子水組成，其各組分的含量為：
20%～55%[w/v]異硫氰酸胍，1mm-25mm乙二胺四乙酸，20-100mm緩沖液，二硫蘇糖醇1%-5%[w/v]，1%-5%表面活性劑，玻璃珠或聚丙烯塑料珠3-10粒。
所述緩沖液可以為tris緩沖液，也可以為磷酸鹽緩沖系統。
所述表面活性劑為tritonx-100、sds、tween20、tritonx-100、np_40、十二烷基肌氨酸鈉、ctab中任意一種或其中2-3種的組合，濃度為1-5%。優選的表面活性劑為tritonx-100。
本發明的優點在于該洗脫液具有成本低，性能穩定，洗脫后樣本可室溫保存運輸，并且具有樣本的滅活作用，可大大降低實驗室暴露感染的風險。
本發明配制的洗脫液可以保存dna/rna,實現拭子樣本洗脫和常溫保存運輸：采用異硫氰酸胍作為離液劑和強變性劑，用于變性裂解細胞，具有抑制dnase/rnase活性功能，可用于保存dna和rna不被酶降解；玻璃珠或聚丙烯塑料珠可以通過物理渦旋撞擊作用，促進細胞從拭子上脫落；乙二胺四乙酸和緩沖液維持了dna/rna的緩沖環境，維持核酸的穩定性。
本發明配制的洗脫液可以滅活病原體：高濃度20%～55%[w/v]異硫氰酸胍作為離液劑和蛋白強變性劑，用于變性裂解細胞；二硫蘇糖醇被用于蛋白質中二硫鍵的還原，促進細胞破裂；表面活性劑（如tritonx-100）是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑），它能溶解脂質，以增加抗體對細胞膜的通透性，促進細胞破裂，從而滅活病原微生物。
本發明配制的洗脫液不影響后續核酸的提?。河捎谙疵撘褐杏玫降漠惲蚯杷犭沂浅Ｒ姷暮怂崽崛∮没瘜W組分，所以不影響后續核酸提取。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做更加詳細的說明。
實施例1
1、拭子洗脫液的配制：
取合適體積的燒杯，按照下表1配方稱量試劑并依次加入燒杯，添加去離子水400ml，加熱攪拌溶解，恢復室溫后，用鹽酸調節ph至6.0，補足去離子水至1l，攪拌后，制備得到1l拭子洗脫液。
表1
2、標本采集處理：取臨床pcr鑒定甲流陽性的患者拭子標本，病毒滴度有代表性，高中低（realtimepcr檢測ct值分別為26、29、32左右）各1例，分別浸入含8ml拭子洗脫液的10ml離心管中；
在渦旋儀上渦旋震蕩5s，丟棄拭子，洗脫物分裝2ml/支；
將洗脫物分別放置于37℃，常溫，4℃，-20℃四個溫度下進行熱穩定性考核。
洗脫物37℃條件放置1天，2天，3天，6天，7天，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本是否穩定。
洗脫物常溫條件放置1天，2天，3天，6天，7天，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本是否穩定。
洗脫物4℃條件放置1周，2周，3周，4周，5周，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本4℃條件放置是否穩定。
洗脫物-20℃條件放置1月，2月，3月，6月，7月，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本-20℃條件放置是否穩定。
3、樣本提取和realtimepcr檢測：
采用qiagenallprepdna/rnaminikit貨號：80204
甲流realtimepcr檢測試劑采用自配試劑，熒光定量pcr體系：1*pcrbuffer、2.5mm鎂離子、0.5utaqdna聚合酶、200μmdntp，上、下游引物（seqidno1-2）量均為200nm，檢測探針fambhq1標記（seqidno3）量為100nm。其引物序列見下表2。
表2
實時熒光pcr設備采用安捷倫mx3005p。
結果分析閾值線：300。
基線：3-15。
4、結果：
37℃保存7天以內，樣本無明顯降解，實驗數據見下表3。
表3
注：第一天有異常數據，剔除。
常溫保存7天以上樣本無明顯降解，實驗數據見下表4。
表4
4℃保存5周以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表5。
表5
-20℃保存半年以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表6。
表6
通過上述考核，證明本發明配制的拭子洗脫液可以保存dna/rna,實現拭子樣本洗脫和常溫的保存。
5、本發明洗脫液的病毒滅活效果實驗：
對拭子洗脫液進行稀釋（稀釋100倍），以去除對細胞的抑制效果，取200ul進行接種；
采用友康nc0201mdck無血清細胞培養基配合nc0204流感病毒分離無血清培養基，進行毒株活性驗證。24h后，均無細胞病變，說明病毒已滅活。
6、上表3、4、5、6中拭子洗脫物提取和realtimepcr結果正常，說明本發明配制的洗脫液對后續提取和realtimepcr實驗無影響。
實施例2
1、拭子洗脫液制備
取合適體積的燒杯，按照下表7配方稱量試劑并依次加入燒杯，添加去離子水400ml，加熱攪拌溶解，恢復室溫后，用鹽酸調節ph至6.0，補足去離子水至1l，攪拌后，即制備得到1l拭子洗脫液。
表7
2、標本采集處理：取臨床pcr鑒定支原體陽性的患者拭子標本，病毒滴度有代表性，高中低（樣本realtime檢測ct值分別為23、26、30左右）各1例，分別浸入含8ml拭子洗脫液的10ml離心管中；
在渦旋儀上渦旋震蕩5s，丟棄拭子，分裝2ml/支；
將洗脫物分別放置于37℃，常溫，4℃，-20℃進行穩定性考核。
洗脫物37℃條件放置1天，2天，3天，6天，7天，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本是否穩定。
洗脫物常溫條件放置1天，2天，3天，6天，7天，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本是否穩定。
洗脫物4℃條件放置1周，2周，3周，4周，5周，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本4℃條件放置是否穩定。
洗脫物-20℃條件放置1月，2月，3月，6月，7月，進行核酸提取和realtimepcr擴增檢測。對多天的檢測ct值進行匯總比較，確定樣本-20℃條件放置是否穩定。
3、樣本提取和realtimepcr檢測：
采用qiagenallprepdna/rnaminikit貨號：80204
支原體realtimepcr檢測試劑采用自配試劑，熒光定量pcr體系：1*pcrbuffer、2.5mm鎂離子、0.5utaqdna聚合酶、200μmdntp，上、下游引物（seqidno4-5）量均為200nm，檢測探針fambhq1標記（seqidno6）量為100nm，其引物序列見下表8。
表8
實時熒光pcr設備采用：安捷倫mx3005p
結果分析閾值線：300。
基線：3-15。
4、結果
37℃保存7天以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表9。
表9
常溫保存7天以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表10。
表10
4℃保存5周以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表11。
表11
-20℃保存半年以上，樣本無明顯降解，實驗數據見下表12。
表12
5、本發明洗脫液的病毒滅活效果實驗：
對拭子洗脫液進行稀釋（稀釋100倍），以去除對細胞的抑制效果，取200ul進行接種。
采用鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的m0502肺炎支原體培養試劑，進行毒株活性驗證。48h后，均無病毒生長，說明支原體已滅活。
6、上表9、10、11、12中拭子洗脫物提取和realtimepcr結果正常，說明本發明配制的洗脫液對后續提取和realtimepcr實驗無影響。