本發明涉及一種干酪乳桿菌來源的d-乳酸脫氫酶及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

手性α-羥基酸是合成許多藥物、化學材料的重要前體物質。例如，苯乳酸(phenyllacticacid,pla)又名2-羥基-3苯基丙酸，存在兩種對映異構體，d-pla和l-pla。d/l-pla均具有廣譜且高效的抑菌活性，是一種新型天然生物防腐劑，可作為飼料添加劑替代畜禽飼料的抗菌劑。

d-乳酸脫氫酶(d-lactatedehydrogenase，d-ldh，ec1.1.1.28)，是脫氫酶中十分重要且研究較多的一種酶，也是生物體內糖酵解途徑中一種關鍵的氧化還原酶。已有研究發現多種d-ldh可不對稱還原苯丙酮酸(phenylpyruvicacid,ppa)生成d-pla，如來源于pediococcusacidilactici和pediococcuspentosaceus的paldh和ppldh，lactobacillusplantarumwcfs1中的d-ldh及lactobacillusbulgaricusatcc11842中的d-nldh等。但是不同的d-ldh不對稱還原ppa的能力存在明顯差異，胡發根等利用來源于lactobacillusplantarum的重組ldh將55mmppa在1h內轉化生成了30.5mmd-pla，摩爾轉化率為54.5％，光學純度達到100％。而來源于lactobacillusbulgaricus的d-nldh突變體偶聯甲酸脫氫酶后可將50mmppa在90min內完全轉化，其d-pla產率為99.0％，eep>99.9％。因此，為獲得高純度，高產量的d-pla，利用分子生物學手段不斷挖掘出性狀優良的d-ldh，具有重要的工業化應用價值。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種來源于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的d-乳酸脫氫酶，命名為lcldhd，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼所述d-乳酸脫氫酶的基因lcldhd。

在本發明的一種實施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。

本發明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.1所示基因。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pet-28a(+)為載體。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

本發明的第四個目的是提供構建所述基因工程菌的方法，是將seqidno.1所示基因與載體連接，轉化至大腸桿菌細胞中。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為pet-28a(+)。

在本發明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21(de3)。

本發明的第五個目的是提供生產所述乳酸脫氫酶的方法，是將所述基因工程菌接種至lb培養基中，培養至od600＝0.6～0.8，加入終濃度為0.4～0.5mmol/l的iptg誘導6～10h。

在本發明的一種實施方式中，所述誘導是在24～28℃進行誘導。

本發明的第六個目的是提供所述d-乳酸脫氫酶的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用是以苯丙酮酸為底物，加入所述d-乳酸脫氫酶，轉化生產d-苯乳酸。

在本發明的一種實施實施方式中，所述應用是向每1mmol苯丙酮酸中加入2～8mg含的該d-乳酸脫氫酶的重組菌的濕菌體，于30～37℃，200～220rpm條件下反應20～60min。

有益效果：本發明構建的重組菌株e.colibl21(de3)pet-28a(+)-lcldhd可將10mmol/l苯丙酮酸在40min內完全不對稱還原生成9.91mmol/lpla，產率為99.1％，對映體過量值(eep)為98.3％，相比于現有技術，在反應時間縮短一倍以上的同時，轉化率提高，取得了預料不到的技術效果。

附圖說明

圖1為e.coli全細胞的sds-page分析；m:proteinmarker；1:e.coli/pet28a；2:e.coli/lcldhd。

具體實施方式

lcldhd的酶活性測定：總反應體系為3ml，包括100mmol/l磷酸鈉緩沖液(ph7.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，對照組中不含nadh，其他成分相同。混勻后于30℃保溫5min，加入適量的酶液。檢測nadh在340nm處吸收值的變化。酶活力單位(u)定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。同時，采用bradford方法測定蛋白含量。

底物和產物的檢測：反應結束后，取一定量的轉化液加入甲醇終止反應，進行反相hplc分析：色譜柱為prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流動相成分：0.05％三氟乙酸/水(a)和0.05％三氟乙酸/甲醇(b)混合液。梯度洗脫程序為：0～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫外光檢測器，柱溫：30℃；流速1ml/min。檢測波長為210nm，苯丙酮酸的保留時間11.372min，pla的保留時間為12.858min。

另取一部分轉化液于1ml乙酸乙酯中進行萃取，上層有機相經無水硫酸鎂干燥后過0.22μm有機濾膜采用正相hplc進行手性分析，色譜柱為daicelod-h(250mm×4.6mm)，分析條件為：流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速為1ml/min，檢測波長為210nm，柱溫：30℃，d-pla和l-pla的保留時間分別為33.889min，35.797min。根據實驗數據計算對映體純度：eep＝[d-pla-l-pla/(d-pla+l-pla)]×100％。

實施例1lcldhd基因的克隆與表達質粒的構建

根據l.caseibl23的d-ldh(caq65269)對應的核苷酸序列設計如下引物：

lcldhd-f：5’-gaattcatgaagattattgcttacgg-3’，含ecori酶切位點。

lcldhd-r：5’-ctcgagctttgctggaccagtaactt-3’，含xhoi酶切位點。

提取l.casei的總dna，以l.casei的總dna為模板，以lcldhd-f和lcldhd-r為引物進行pcr擴增，pcr條件為：94℃4min；94℃30s，52℃30s，72℃1min10s，30個循環；72℃10min。將pcr產物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pucm-t載體連接(pucm-t-lcldhd)，轉化入e.colijm109中，經菌液pcr鑒定正確后送上海生工測序，得到lcldhd核苷酸序列。

將測序結果正確的pucm-t-lcldhd與pet-28a(+)質粒均用ecori和xhoi進行雙酶切，割膠回收的酶切產物在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-28a(+)-lcldhd，并對重組質粒進行序列測定。

實施例2重組菌的構建與誘導表達

將pet-28a(+)-lcldhd轉化入e.colibl21(de3)中，經含有kan的抗性平板篩選后，挑取陽性轉化子于2ml含kan的抗性lb液體培養基中，37℃220rpm搖床振蕩培養14～16h。按1～2％的接種量轉接于30ml相同培養基中，37℃220rpm搖床振蕩培養至對數生長中期(od600＝0.6～0.8)，加入終濃度為0.4mmol/l的iptg，16℃220rpm誘導培養10h。對照組分別用僅含空pet-28a(+)在相同條件下培養(e.colipet28a)。誘導結束后，離心收集菌體并用磷酸鹽緩沖液(ph＝7.0)洗滌兩次后制備含100mg/ml濕細胞的菌懸液，用于sds-page分析，分析結果見圖1，構建成功的重組菌e.colibl21(de3)pet-28a(+)-lcldhd在37.8kda處有明顯的蛋白條帶，對照e.colipet28a沒有大小相同的蛋白條帶。

實施例3重組菌全細胞催化苯丙酮酸生成d-pla

于1ml離心管中加入300μl菌懸液(30mg濕菌體)和250μl磷酸鈉緩沖液(ph7.0)，37℃保溫5min，再依次加入50μl葡萄糖(終濃度50mmol/l)和400μl苯丙酮酸(終濃度10mmol/l)，反應40min后，取200μl反應液加入800μl甲醇終止反應，過0.22μm有機濾膜，進行hplc分析；利用液相色譜測定lcldhd重組菌轉化10mmol/l苯丙酮酸生成pla的產量及對映選擇性分析，結果顯示pla的濃度為9.31～9.92mmol/l。

另取200μl反應液，用1ml乙酸乙酯進行萃取，上層有機相經無水硫酸鈉干燥后過0.22μm有機濾膜，進行對映選擇性分析。結果顯示，當體系反應20min后d-pla的產率為76.9％，eep為98％。在反應40min后，苯丙酮酸完全被還原生成d-pla，產率為99.1％，eep為98.3％。對照例1

具體實施方式同實施例2，區別在于，用僅含空pet-28a(+)和無iptg誘導的工程菌在相同條件下誘導表達，測得兩種工程菌催化苯丙酮酸獲得d-pla的濃度僅為0.81mmol/l和0.78mmol/l。

對照例2

合成編碼genbank登錄號為：kde85061.1的d-乳酸脫氫酶基因序列，將該基因命名為aoldh，按照實施例1的策略克隆該基因和構建表達質粒pet28a(+)-aoldh。

aoldh-f:5′–catatgatgaagctagcagtcttcag–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點

aoldh-r:5′–ctcgagtaaccggacaggctcctt–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。

根據實施例2的策略，將aoldh在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coliaoldh。將重組菌按照實施例2的步驟進行誘導表達得到aoldh，按照實施例3將e.coliaoldh菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應12h后進行液相檢測，結果顯示該重組菌產生的pla濃度與表達空質粒的對照組相同，表明aoldh對苯丙酮酸無催化活性。

對照例3

按實施例2的方式對重組菌進行誘導，區別在于調整誘導溫度為12℃，在其余的條件相同的情況下，d-苯乳酸濃度僅4.02～4.75mm。

對照例4

按實施例2的方式對重組菌進行誘導，區別在于調整誘導溫度為20℃，8h，在其余的條件相同的情況下，d-苯乳酸濃度僅5.02～5.75mm。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種干酪乳桿菌來源的d-乳酸脫氫酶及其應用

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