本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應用，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

苯乳酸(phenyllactateacid，pla)，系統(tǒng)名為2-羥基-3-苯基丙酸，是一種高值有機酸，其具有兩種對映異構體：l-pla和d-pla。pla的分子式為c9h10o3，相對分子質量為166.17，其性質穩(wěn)定，熔點為121～125℃；pla在水中溶解度較好，并且其在水溶液中有較好的熱穩(wěn)定性。l-pla和d-pla都具有廣譜抑菌效果，可作為天然抑菌劑，替代化學合成的防腐劑，而且可經(jīng)聚合反應合成聚苯乳酸新型高分子材料，替代聚乳酸高分子材料。因此，苯乳酸在化工、制藥、生物、材料和食品等領域有廣闊的應用前景。

pla可由多種微生物代謝產(chǎn)生，是菌體在代謝途徑中一個副產(chǎn)物，如大多數(shù)的乳酸菌如植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)等，也有一些真菌如白地霉(geotrichumcandidum)，熒光維克酵母(wickerhamiafluorescens)tk1可產(chǎn)pla，但現(xiàn)有的野生菌株自產(chǎn)pla的濃度很低。目前，pla可以通過化學和生物的方法合成，但由于化學方法苛刻的反應條件、復雜的技術路線、副產(chǎn)物多不易分離，尤其對環(huán)境造成污染等缺點，生物合成法因其高效性，反應條件溫和等優(yōu)點，近年來受到廣大研究者的青睞。

已有研究表明，微生物中多種l-乳酸脫氫酶可不對稱還原苯丙酮酸生成l-pla，但是不同l-ldh不對稱還原苯丙酮酸的能力存在明顯差異，如賈江花等克隆表達了來源于植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)中的l1-ldh和l2-ldh基因，重組l1-ldh對苯丙酮酸的比活力為71.06u/mg，而重組l2-ldh對苯丙酮酸的比活力僅為0.06u/mg，并未測定其對映體純度。王穎等克隆了來源于bacillusmegateriumz2013513的ldhl基因并在大腸桿菌中實現(xiàn)表達，測得粗酶液對苯丙酮酸的酶活力為3.4u/mg。在37℃、200r/min條件下，25g/l(干重)重組菌經(jīng)60min將70.32mmol/l苯丙酮酸全細胞轉化合成50.59mmol/ll-pla，eep為96.89％，底物摩爾轉化率僅為71.94％。因此，利用分子生物學手段不斷挖掘出性狀優(yōu)良的l-ldh，對于獲得高純度，高產(chǎn)量的l-pla具有重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種來源于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶，lcldh1，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有苯丙酮酸還原活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發(fā)明的第二個目的是提供編碼所述l-乳酸脫氫酶的基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種基因工程菌，是以大腸桿菌為宿主，表達seqidno.1所示的l-乳酸脫氫酶基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因工程菌以pet-22b(+)為載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

本發(fā)明的第四個目的是提供構建所述基因工程菌的方法，是將seqidno.1所示基因與載體連接，轉化至大腸桿菌細胞中。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述載體為pet-22b(+)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述宿主為e.colibl21(de3)。

本發(fā)明的第五個目的是提供生產(chǎn)所述乳酸脫氫酶的方法，是將所述基因工程菌接種至lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至od600＝0.6～0.8，加入終濃度為0.3～0.5mmol/l的iptg誘導6～10h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述誘導是在18～22℃進行誘導。

本發(fā)明的第六個目的是提供所述l-乳酸脫氫酶的應用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述應用是以苯丙酮酸為底物，加入所述l-乳酸脫氫酶，轉化生產(chǎn)l-苯乳酸。

在本發(fā)明的一種實施實施方式中，所述應用是向每1mmol/l苯丙酮酸中加入3mg含所述乳酸脫氫酶的重組濕菌體，于30～37℃200～220rpm條件下反應30～120min。

本發(fā)明的有益效果：來源于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的l-乳酸脫氫酶基因序列克隆，l-乳酸脫氫酶工程菌的構建以及重組l-乳酸脫氫酶的異源表達和活性測定的方法。本發(fā)明構建的重組菌株e.coli/lcldh1在反應80min后可不對稱還原10mmol/l苯丙酮酸生成8.59mmol/l的l-苯乳酸，產(chǎn)率為85.9％，對映體過量值(eep)>99％。純化的lcldh1對苯丙酮酸的比活性為294.2u/mg。

附圖說明

圖1為重組lcldh1的sds-page分析；其中，m:proteinmarker；1:e.coli/pet22b全細胞(對照菌)；2:e.coli/lcldh1全細胞；3純化后的lcldh1。

具體實施方式

lcldh1的活性測定：總反應體系，包括50mmol/l乙酸鈉緩沖液(ph5.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，對照組中不含nadh，其他成分相同。混勻后于30℃保溫5min，加入適量的酶液。檢測nadh在340nm處吸收值的變化。酶活力單位(u)定義為：在上述條件下，每分鐘催化氧化1μmolnadh所需要的酶量。同時，采用bradford方法測定蛋白含量。

底物和產(chǎn)物的檢測：反應結束后，取一定量的轉化液加入甲醇終止反應，進行反相hplc分析：色譜柱為prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流動相成分：0.05％三氟乙酸/水(a)和0.05％三氟乙酸/甲醇(b)混合液。梯度洗脫程序為：0～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫外光檢測器，柱溫：30℃；流速1ml/min。檢測波長為210nm，ppa的保留時間11.372min，pla的保留時間為12.858min。

另取一部分轉化液于1ml乙酸乙酯中進行萃取，上層有機相經(jīng)無水硫酸鎂干燥后過0.22μm有機濾膜采用正相hplc進行手性分析，色譜柱為daicelod-h(250mm×4.6mm)，分析條件為：流動相為正己烷/異丙醇/三氟乙酸(98:2:0.05，v/v)，流速為1ml/min，檢測波長為210nm，柱溫：30℃，d-pla和l-pla的保留時間分別為33.896min，35.806min。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)計算對映體過量值：eep＝[l-pla-d-pla/(l-pla+d-pla)]×100％。

實施例1lcldh1基因的克隆與表達質粒的構建

根據(jù)l.caseibl23的l-ldh(cap07851)對應的核苷酸序列設計如下引物：

lcldh1-f：5’-catatggtggcaagtattacggataa-3’，含ndei酶切位點。

lcldh1-r：5’-ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt-3’，含xhoi酶切位點。

提取干酪乳桿菌的總dna，以lcldh1-f和lcldh1-r為引物進行pcr擴增，pcr條件為：94℃4min；94℃30s，51℃30s，72℃1min10s，30個循環(huán)；72℃10min。將pcr產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳分析，割膠回收目的條帶并與pucm-t載體連接(pucm-t-lcldh1)，轉化入e.colijm109中，經(jīng)菌液pcr鑒定正確后送上海生工測序，得到lcldh1核苷酸序列。將測序結果正確的pucm-t-lcldh1與pet-22b(+)質粒均用ndei和xhoi進行雙酶切，割膠回收的酶切產(chǎn)物在t4dna連接酶的作用下進行連接，得到重組質粒pet-22b(+)-lcldh1，并對重組質粒進行序列測定。

實施例2重組菌e.coli/lcldh1的構建與誘導表達

將pet-22b(+)-lcldh1轉化入e.colibl21(de3)中，經(jīng)含有amp的抗性平板篩選后，挑取陽性轉化子于2ml含amp的抗性lb液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm搖床振蕩培養(yǎng)14～16h。按2％的接種量轉接于30ml相同培養(yǎng)基中，37℃220rpm搖床振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期(od600＝0.6～0.8)，加入iptg至終濃度為0.4mmol/l，20℃220rpm誘導培養(yǎng)8h。誘導結束后，離心收集菌體并用磷酸鹽緩沖液(ph＝7.0)洗滌數(shù)次，用于sds-page分析。以僅含空pet-22b(+)的菌株為對照，結果見圖1，重組菌e.coli/lcldh1(即e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1)在36.4kda處具有大小與目的酶相同的蛋白條帶，對照菌沒有條帶。利用液相色譜測定lcldh1轉化苯丙酮酸生成pla的產(chǎn)量及測定產(chǎn)物的對映選擇性。對照組分別用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導的工程菌在相同條件下培養(yǎng)。8000rpm，5min收集菌體。加入一定量的破碎液(20mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl)，超聲破碎后，4℃，12000rpm，10min離心取上清液即為粗酶液，經(jīng)測定，其酶活為93.99u/ml。經(jīng)ni-nta親和層析和凝膠過濾層析純化破碎液，測定純lcldh1的比活性。經(jīng)測定，純化后的酶液的比酶活為294.2u/mg。

實施例3重組菌全細胞催化苯丙酮酸生成l-pla

于1ml離心管中加入300μl菌懸液(30mg濕菌體)和250μl磷酸鈉緩沖液(ph7.0)，37℃保溫5min，再依次加入50μl葡萄糖(終濃度50mmol/l)和400μl苯丙酮酸(終濃度10mmol/l)，反應1h后，取200μl反應液加入800μl甲醇終止反應，過0.22μm有機濾膜，進行hplc分析；另取200μl反應液，用1ml乙酸乙酯進行萃取，上層有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后過0.22μm有機濾膜，進行對映選擇性分析。結果顯示，當體系反應40min后，l-pla的濃度為5.62mmol/l，產(chǎn)率為56.2％，eep>99％，當反應80min后，苯丙酮酸完全被消耗，產(chǎn)生8.59mmol/l的l-pla，產(chǎn)率為85.9％，eep>99％。

對照例1

具體實施方式同實施例2，區(qū)別在于，用僅含空pet-22b(+)和無iptg誘導的工程菌在相同條件下誘導表達，按照實施例3測得兩種工程菌催化苯丙酮酸，獲得l-pla的濃度僅為0.32mmol/l和0.46mmol/l。

對照例2

合成編碼genbank登錄號為kte98134.1l-乳酸脫氫酶的基因序列，將該基因命名為lcldh2，按照實施例1的策略克隆該基因和構建表達質粒pet22b(+)-lcldh2，引物設計為：

lcldh2-f:5′–catatgatggcaagaacaattggt–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點

lcldh2-r:5′–ctcgagcttcattttttcaaaggtatc–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。

根據(jù)實施例2的策略，將lcldh2在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coli/lcldh2。將重組菌按照實施例2的步驟進行異源表達得到lcldh2，按照實施例3將e.coli/lcldh2菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應1h后進行液相檢測，結果產(chǎn)生3.5mmol/ll-pla，產(chǎn)率僅為35％，粗酶液的酶活力為47.3u/mg。

對照例3

合成編碼genbank登錄號為cap07856.1的基因序列，將該基因命名為lcldh3，按照實施例1的策略克隆該基因和構建表達質粒pet22b(+)-lcldh3。

lcldh3-f:5′–catatgatgcggaacaacggcaatat–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點

lcldh3-r:5′–ctcgagagcttcttgagccttcttca–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。

根據(jù)實施例2的策略，將lcldh3在e.colibl21(de3)中進行異源表達，得到重組菌e.coli/lcldh3。將重組菌按照實施例2的步驟進行誘導表達得到lcldh3，按照實施例3的步驟將e.coli/lcldh3菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應1h后進行液相檢測，結果產(chǎn)生2.7mmol/ll-pla，產(chǎn)率為27％，粗酶液的酶活力為42.5u/mg。

對照例4

按照實施例1，將lcldh1連接至pet28a(+)載體上，獲得重組質粒pet28a-lcldh1，將重組質粒導入bl21(de3)中，得到重組菌bl21/pet28a-lcldh1并進行誘導表達，按照實施例3將bl21/pet28a-lcldh1菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應1h后進行液相檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生l-pla的濃度和lcldh1的對映選擇性相比于e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1并沒有提高。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

sequencelisting

<110>江南大學

<120>一種干酪乳桿菌來源的l-乳酸脫氫酶及其應用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>978

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtggcaagtattacggataaggatcaccaaaaagttattctcgttggtgacggcgccgtt60

ggttcaagttatgcctacgcaatggttttgcaaggtatcgctcaggaaatcggaatcgtt120

gacattttcaaggacaagacaaagggtgacgcgattgacttgagcaacgcgctcccattc180

acaagtcctaagaagatttattcagctgaatacagcgatgctaaggatgctgatctggtt240

gttatcacagctggcgctcctcagaagcctggcgaaactcgtttggacttggttaacaag300

aacttgaagatcttgaagtccattgttgacccaatcgttgattccggctttaacggtatt360

ttcttagttgctgccaacccagttgacattttgacctatgcaacttggaaactttctggc420

ttcccgaagaaccgggttgttggttccggtacttcactggacaccgcccgcttccgtcag480

tccattgctgaaatggttaatgttgacgctcgttcggtccacgcttacatcatgggcgaa540

catggtgacactgaattccctgtatggtcccacgctaacattggtggcgttaccatcgct600

gaatgggttaaggctcatccagaaatcaaggaagacaagcttgttaagatgtttgaagac660

gttcgtgacgccgcttatgaaatcatcaaactcaagggtgcgaccttctatggtatcgca720

actgcccttgcccggatttcaaaggcaatccttaacgacgaaaatgcggttctgccactt780

tccgtttacatggatggtcaatatggcttgaacgacatctacatcggtaccccagctgtg840

atcaaccgtaatggtatccagaacatcctggaaatcccattgaccgatcacgaagaagaa900

tccatgcagaaatctgcttctcaattgaagaaggctctgaccgatgctttcgctaagaat960

gacatcgaaactcgtcag978

<210>2

<211>326

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

valalaserilethrasplysasphisglnlysvalileleuvalgly

151015

aspglyalavalglysersertyralatyralametvalleuglngly

202530

ilealaglngluileglyilevalaspilephelysasplysthrlys

354045

glyaspalaileaspleuserasnalaleuprophethrserprolys

505560

lysiletyrseralaglutyrseraspalalysaspalaaspleuval

65707580

valilethralaglyalaproglnlysproglygluthrargleuasp

859095

leuvalasnlysasnleulysileleulysserilevalaspproile

100105110

valaspserglypheasnglyilepheleuvalalaalaasnproval

115120125

aspileleuthrtyralathrtrplysleuserglypheprolysasn

130135140

argvalvalglyserglythrserleuaspthralaargphearggln

145150155160

serilealaglumetvalasnvalaspalaargservalhisalatyr

165170175

ilemetglygluhisglyaspthrglupheprovaltrpserhisala

180185190

asnileglyglyvalthrilealaglutrpvallysalahisproglu

195200205

ilelysgluasplysleuvallysmetphegluaspvalargaspala

210215220

alatyrgluileilelysleulysglyalathrphetyrglyileala

225230235240

thralaleualaargileserlysalaileleuasnaspgluasnala

245250255

valleuproleuservaltyrmetaspglyglntyrglyleuasnasp

260265270

iletyrileglythrproalavalileasnargasnglyileglnasn

275280285

ileleugluileproleuthrasphisglugluglusermetglnlys

290295300

seralaserglnleulyslysalaleuthraspalaphealalysasn

305310315320

aspilegluthrarggln

325

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

catatggtggcaagtattacggataa26

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt27

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

catatgatggcaagaacaattggt24

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctcgagcttcattttttcaaaggtatc27

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

catatgatgcggaacaacggcaatat26

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ctcgagagcttcttgagccttcttca26