技術領域：

本發明屬于轉基因產品檢測領域，具體涉及轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

背景技術：
：

目前上市的轉基因甜菜品系共有三個：gtsb77、t120-7和h7-1，其中h7-1已獲得我國農業部批準用于飼料。轉基因甜菜gtsb77是由諾華公司和孟山都公司通過農桿菌介導法將導入甜菜，研發出具抗草甘膦除草劑抗性的甜菜品系，商品名為：invigor^tmsugarbeet。1998年-2004年間，美國、日本、加拿大、澳大利亞、菲律賓相繼批準甜菜gtsb77品系作為食品或飼料用途，中國尚未批準轉基因甜菜gtsb77批準用于食品和飼料。目前美國和加拿大95％以上種植的甜菜均為轉基因甜菜。

gtsb77(glyphosate-tolerantsugarbeetline77)由轉入三個基因研發而成：cp4-epsps基因、uida基因和修飾過的gox基因。cp4-epsps基因和gox基因均為草甘膦除草劑耐受基因(cp4-epsps基因編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶對草甘膦除草劑不敏感；gox基因編碼草甘膦氧化還原酶而降解除草劑，然而由于其在翻譯過程中被截斷，其序列69％與甜菜基因融合形成嵌合基因，盡管嵌合基因序列能進行mrna轉錄，但沒有新的蛋白翻譯產生，因此轉基因甜菜gtsb77沒有gox酶活性。)。

目前對轉基因產品多數國家均采用相應的標識管理制度，標識管理制度的建立和實施依賴于有效準確的檢測鑒定技術。品系特異性pcr(轉化事件特異性)(event-specificpcr)檢測的目標序列是外源插入序列與植物基因組間連接區，相較于篩選pcr(screeningpcr)、基因特異性pcr(gene-specificpcr)、構建特異性pcr(construct-specificpcr)具有更加高的具有高特異性，甚至能用于檢測鑒定相同質粒轉化的轉基因具體品系，是目前轉基因品系鑒定檢測技術研究和實際檢測工作中的重要方法。

為打破其他國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，完善和我國轉基因產品定量檢測技術體系，保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，為進出境口岸監管部門提供轉基因不同品系標識檢測鑒定的方法，建立轉基因甜菜gtsb77品系特異性定量pcr精準檢測方法十分必要。目前歐盟等其他國家和地區均尚無轉基因甜菜gtsb77品系特異性定量檢測方法。

技術實現要素：
：

本發明的目的是提供一種特異性好、靈敏度高、穩定性強，快速準確鑒別轉基因甜菜gtsb77品系的轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒。

本發明的第一個目的是提供一種轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

gtsb77-f：5’-aacgtggataccacatcgtgatc-3’(如seqidno.1所示)；

gtsb77-r：5’-gaagtccaaatcagccgaaattt-3’(如seqidno.2所示)。

本發明的第二個目的是提供一種轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：

gtsb77-p：5’-cccagaagctgctccacgtattccaa-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。

所述的熒光報告基團優選為fam，所述的熒光淬滅基團優選為bhq1。

本發明的第三個目的是提供一種轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測試劑盒，包括實時熒光定量pcr反應液、耐熱dna聚合酶、檢測引物和檢測探針，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

gtsb77-f：5’-aacgtggataccacatcgtgatc-3’(如seqidno.1所示)；

gtsb77-r：5’-gaagtccaaatcagccgaaattt-3’(如seqidno.2所示)；

所述的檢測探針如下所示：

gtsb77-p：5’-cccagaagctgctccacgtattccaa-3’(如seqidno.3所示)，探針的5’端標記有熒光報告基團，3'端標記有熒光淬滅基團。

本發明的第四個目的是提供一種轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取樣品的基因組dna作為模板；

(2)加入上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系；

(3)將擴增反應體系在熒光pcp儀上進行實時熒光pcr反應，反應結束后，根據擴增曲線判斷樣品是否為轉基因甜菜gtsb77品系。

優選，所述的步驟(2)的擴增反應體系為：25μl，包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l檢測引物gtsb77-f和gtsb77-r各0.5μl，10μmol/l檢測探針gtsb77-p0.5μl，dna模板2μl和ddh2o8.8μl；所述的步驟(3)的實時熒光pcr反應，其反應程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環，于60℃收集熒光信號。

優選，所述的步驟(3)的根據擴增曲線判斷樣品是否為轉基因甜菜gtsb77品系的標準為：如果擴增曲線有典型熒光擴增曲線，則說明樣品為轉基因甜菜gtsb77品系；如果擴增曲線無典型熒光擴增曲線，則說明樣品不是轉基因甜菜gtsb77品系。

本發明的第五個目的是提供一種轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取轉基因甜菜gtsb77品系的基因組dna進行梯度稀釋以用作不同起始濃度的模板，分別加入上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系，在熒光pcr儀上進行實時熒光pcr反應；

(2)反應后得到各起始濃度模板對應的ct值，該ct值與起始模板量的常用對數(lg)呈線性關系，據此得到該線性范圍內轉基因甜菜gtsb77品系的標準曲線；

(3)提取待測樣品的基因組dna為模板，加入與步驟(1)中相同體系的上述的檢測引物和檢測探針，與實時熒光定量pcr反應液及耐熱dna聚合酶混合形成擴增反應體系，在熒光pcp儀上進行實時熒光pcr反應，反應后得到ct值，將其代入步驟(2)獲得的轉基因甜菜gtsb77品系的標準曲線，計算得到待檢樣品中轉基因甜菜gtsb77品系基因組dna的含量(拷貝數或質量)。

本發明針對轉基因甜菜gtsb77品系特異性序列(gtsb77品系轉入的基因盒3’端gox區域與甜菜基因組鄰接區序列)設計引物和taqman探針，建立轉基因甜菜gtsb77實時熒光聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，pcr)檢測方法，利用該檢測引物和檢測探針，按照本發明的方法進行檢測發現其定量檢測下限為16拷貝，建立的標準曲線線性相關系數(r²)為0.99，擴增效率e為101％，重復性實驗顯示本方法的標準偏差(sd)及相對標準偏差(rsd)都在可接受范圍內，特異性良好、靈敏度高、穩定性強，可滿足監管部門和公眾對轉基因甜菜gtsb77進行品系特異性檢測鑒定的需求。

附圖說明：

圖1是甜菜內源基因gs特異性擴增圖，1～4分別為gs-gtsb77質粒、轉基因甜菜h7-1、非轉基因甜菜荷蘭kuhn8060和非轉基因甜菜吉甜2045擴增曲線，陰性擴增分別為：轉基因油菜mon88302、轉基因苜蓿j101、轉基因苜蓿j163、轉基因玉米mon810、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、非轉基因大麥、非轉基因玉米和非轉基因大豆、陰性對照和空白對照。

圖2是轉基因甜菜gtsb77品系特異性檢測方法特異性實驗結果，1為gs-gtsb77質粒；2～17分別為：轉基因油菜mon88302、轉基因苜蓿j101、轉基因苜蓿j163、轉基因玉米mon810、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、非轉基因大麥、非轉基因甜菜荷蘭kuhn8060、非轉基因甜菜吉甜2045、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米和非轉基因大豆、陰性對照和空白對照。

圖3是轉基因甜菜gtsb77品系特異性檢測靈敏度試驗擴增圖；1～8分別為：800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl質粒dna。

圖4是實時熒光pcr檢測甜菜內源基因gs的標準曲線，quantity表示dna模板量(拷貝數)。

圖5是實時熒光pcr檢測轉基因甜菜gtsb77品系的標準曲線，quantity表示dna模板量(拷貝數)。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

主要材料：轉基因油菜mon88302、轉基因苜蓿j101、轉基因苜蓿j163、轉基因玉米mon810、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、非轉基因大麥、非轉基因甜菜荷蘭kuhn8060、非轉基因甜菜吉甜2045、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米和非轉基因大豆為本實驗室購置儲備，甜菜內源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)和轉基因甜菜gtsb77品系特異性片段雙基因陽性質粒(雙基因陽性質粒為將內源基因gs基因片段160bp序列(如seqidno.4所示)和轉基因甜菜gtsb77品系特異性片段379bp序列(如seqidno.5所示)共539bp序列(如seqidno.6所示)克隆到ampr抗性的puc57載體上構建得到的重組質粒，將重組質粒轉入受體菌dh5a后-70℃保存。以下稱gs-gtsb77質粒)為本實驗室構建。

選擇甜菜內源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)(參考文獻：mazzaram,fotin,savinic,vandeneedeg.event-specificmethodforthequantitationofsugarbeetlineh7-1usingreal-timepcr-validationreportandprotocol.eur22134en.2006.jrc32190)引物gs-f/r和探針gs-p用于檢測甜菜樣品基因組dna是否成功提取以及是否適于進行實時熒光pcr擴增；其序列信息詳見表1。

主要試劑：primexextaq(2×)forqpcr，大連寶生物；dna提取試劑盒，北京天根公司；引物和探針由閃晶生物公司合成，稀釋為終濃度為10μm的工作液使用。

主要儀器與設備：

abi7500，abi7500fast實時熒光定量pcr儀，美國應用生物系統公司；qx200微滴式數字pcr系統，美國伯樂公司；nanodrop2000c微量分光光度計，美國thermo公司；研磨機，德國ika。

農作物材料樣品基因組dna采用常規方法提取與純化。

實施例1：實時熒光pcr檢測方法的建立

根據轉基因甜菜gtsb77品系轉入的基因盒3’端gox區域與甜菜基因組鄰接區序列(轉基因甜菜gtsb77品系特異性片段，如seqidno.5所示)，應用primerprimer5.0軟件設計引物和探針。將設計的引物、探針經ncbi網站上使用blast數據庫比對確定引物和探針的理論特異性；甜菜內源基因谷氨酰胺合成酶基因(glutaminesynthetase,gs)，用于甜菜來源樣品dna的檢測及轉基因成分的相對定量。具體引物探針信息見表1。

表1實時熒光pcr的引物、探針

擴增反應體系為25μl：包括premixextaqtm12.5μl，roxreferencedyeii0.2μl，10μmol/l上游引物和下游引物各0.5μl，10μmol/l檢測探針0.5μl，dna模板2μl和ddh2o8.8μl；反應程序為95℃30s；95℃5s、60℃34s，40個循環，于60℃收集熒光信號。

實施例2：實時熒光pcr方法特異性測試

采用轉基因油菜mon88302、轉基因苜蓿j101、轉基因苜蓿j163、轉基因玉米mon810、轉基因大豆gts40-30-2、轉基因玉米bt11、轉基因玉米mir162、轉基因玉米nk603、非轉基因大麥、非轉基因甜菜荷蘭kuhn8060、非轉基因甜菜吉甜2045、轉基因甜菜h7-1、非轉基因玉米和非轉基因大豆的基因組dna為模板，陽性樣品為gs-gtsb77質粒，陰性對照為非轉基因大米dna。對建立的實時熒光pcr檢測方法的特異性進行測試。實時熒光pcr檢測反應體系和反應程序同實施例1。

結果顯示，采用引物gs-f/r和探針gs-p對所有提取的樣品的dna進行實時熒光pcr時，只有非轉基因甜菜荷蘭kuhn8060、非轉基因甜菜吉甜2045、轉基因甜菜h7-1和gs-gtsb77質粒來源的dna模板出現擴增曲線，其他農作物無典型擴增曲線，表明甜菜內源基因gs擴增結果正確(圖1)。

采用gtsb77品系特異性引物gtsb77-f/r和探針gtsb77-p對所有提取的樣品的dna進行實時熒光pcr時，只有陽性樣品gs-gtsb77質粒的dna模板有典型熒光擴增曲線，以其他農作物材料dna為模板的均無典型熒光擴增曲線(圖2)。表明本發明的檢測方法特異性良好。

實施例3：靈敏度測試、可重復性測試及標準曲線建立

將提取的gs-gtsb77質粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl作為dna模板進行轉基因甜菜gtsb77實時熒光pcr檢測，實時熒光pcr檢測反應體系和反應程序同實施例1，進行靈敏度測試；測試結果顯示(圖3)，800000-8copies/μl范圍內7個濃度梯度三個平行均能有典型擴增曲線，而到4copies/μl濃度只有一個平行有擴增曲線，顯示其結果不穩定。所以最低檢測濃度為8copies/μl。擴增圖1-8分別為800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl擴增曲線。

將提取的gs-gtsb77質粒dna溶液加te緩沖液分別稀釋至800000、80000、8000、800、80、40、8和4copies/μl作為dna模板，進行轉基因甜菜gtsb77實時熒光pcr檢測，進行線性范圍測試及可重復性測試，每個樣品進行3次重復實驗，水為空白對照，實時熒光pcr檢測反應體系和反應程序同實施例1。結果如表2所示。在模板量16-1600000copies(2μl/25μl體系)范圍內7個濃度(其中4cpies/μl的濃度檢測結果不穩定，三個平行只有一個ct值，故不列入線性范圍計算)的對數值與所得ct值建立標準曲線(圖5)，線性回歸方程為：y＝-3.295x+40.385，r²為0.997，擴增效率為101％(介于90％～110％)，表明其線性相關性良好，擴增效率高，均符合engl相關要求[definitionofminimumperformancerequirementsforanalyticalmethodsofgmotesting]；在模板量為16-1600000copies的范圍內，其ct值的sd介于0.02-0.61，rsd介于0.05％-1.64％，表明在最低模板量16copies時，其sd和rsd均小于25％。所以本發明的定量檢測下限為16copies。實時熒光pcr檢測甜菜內源基因gs的標準曲線見圖4，線性方程為：y＝-3.292+41.06，r²:0.995，擴增效率101％，均滿足相關要求。

表2實時熒光pcr方法的靈敏度及可重復性測試

本發明針對轉基因甜菜gtsb77品系轉入的基因盒3’端gox區域與甜菜基因組鄰接區序列設計引物和探針，建立的轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測方法，可對轉基因甜菜gtsb77進行品系特異性快速、高通量的定性及定量檢測，滿足檢測、監管部門對其進行標識的需求。

序列表

<110>中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局

<120>轉基因甜菜gtsb77品系特異性實時熒光pcr檢測引物、探針、方法和試劑盒

<160>6

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

aacgtggataccacatcgtgatc23

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gaagtccaaatcagccgaaattt23

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccagaagctgctccacgtattccaa26

<210>4

<211>160

<212>dna

<213>甜菜

<400>4

cacgcatccaccccaccatgcatctctctctgtctcccacaggggagccaggatggcgta60

ctgagcctggatgacaatgactctcagcatctgcctccctacgggaactactaccagaac120

ctggggggcgatggcaacatcaggagaaactacgaactgt160

<210>5

<211>379

<212>dna

<213>轉基因甜菜gtsb77

<400>5

cgtgttatcggattcgagactgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggt60

gttcttgctgttgatgcagctgttgttgcagctggtgcacactccaagtctcttgctaac120

tcccttggtgatgacatcccattggataccgaacgtggataccacatcgtgatcgccaac180

ccagaagctgctccacgtattccaactaccgatgcttctggaaagttccggtccaaattt240

gtttacattgtgtccaaatttcggctgatttggacttccctagctatgccaactaagcta300

ataaaaaacatgaaacaacaattacaaactgtcgagcacaccttctacaaactagcttag360

atttctattggaagttaca379

<210>6

<211>539

<212>dna

<213>gs-gtsb77質粒

<400>6

cacgcatccaccccaccatgcatctctctctgtctcccacaggggagccaggatggcgta60

ctgagcctggatgacaatgactctcagcatctgcctccctacgggaactactaccagaac120

ctggggggcgatggcaacatcaggagaaactacgaactgtcgtgttatcggattcgagac180

tgaaggtcgtgctctcaagggtatcaccaccaccaacggtgttcttgctgttgatgcagc240

tgttgttgcagctggtgcacactccaagtctcttgctaactcccttggtgatgacatccc300

attggataccgaacgtggataccacatcgtgatcgccaacccagaagctgctccacgtat360

tccaactaccgatgcttctggaaagttccggtccaaatttgtttacattgtgtccaaatt420

tcggctgatttggacttccctagctatgccaactaagctaataaaaaacatgaaacaaca480

attacaaactgtcgagcacaccttctacaaactagcttagatttctattggaagttaca539