本發明涉及一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術：

旱稻孢囊線蟲(heteroderaelachista)是一種主要侵染水稻的植物寄生線蟲，最早于日本櫪木縣的稻田中被發現(ohshimay.heteroderaelachistansp.anuplandricecystnematodefromjapan[j].japanesejournalofnematology，1974(4):51-56.)。目前該線蟲病害在湖南省多個縣(市)丘陵地帶的水稻田首次發現(dingz，namphuengj，hexf.firstreportofthecystnematode(heteroderaelachista)onriceinhunanprovince,china[j].plantdisease,2012,96(1):151)。旱稻孢囊線蟲一般寄生在寄主根部，其危害癥狀與水肥失調引起的癥狀極其相似，除吸收寄主的營養和對植物根部造成傷害外，還降低水稻對水的利用效率，繼而影響寄主的生長和發育(丁中,namphuengjanthathang,何旭峰等.旱稻孢囊線蟲生活史及侵染特性[j].中國水稻科學,2012,26(6):746-750)，造成水稻減產7％～19％(bridgej，lucm，plowrightra.plantparasiticnematodesintropicalandsubtropicalagriculture[m].wallingford：cabinternational,1990:69–108)。目前旱稻孢囊線蟲病主要發生在長江中下游水稻種植區，且危害日趨嚴重，有可能成為我國的水稻生產中的又一嚴重威脅，同時該線蟲病害的發生分布還不十分的明確，對該線蟲做出快速準確的鑒定是當前麥類作物生產急需解決的問題。

旱稻孢囊線蟲屬于cyperi群組，在形態上與h.oryzae、h.sacchari和h.leuceilyma非常相近。其與h.sacchari和h.leuceilyma最明顯的區別是在孢囊細長的下橋上缺乏指形的投影，而與h.oryzae相比，孢囊略小，二齡幼蟲長度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統的形態學鑒定方法，但是由于形態學鑒定耗時、需要很熟練的技術作為基礎，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統的鑒定方法時常存在一定誤差并且不適用于大規模的樣品檢測。

近年來，隨著分子生物學的快速發展，pcr等快速檢測技術已經廣泛的運用到植物線蟲的快速檢測和鑒定中。目前運用到孢囊線蟲的檢測技術主要包括its-rflp,pcr，realtimepcr等。

amiri等通過對h.betae、h.ciceri、h.glycines和h.medicaginis、h.schachtii、h.trifolii的its序列進行分析，篩選出特異性引物shf6，將此引物與ab28(或rdna2)引物結合，構建了甜菜孢囊線蟲一步雙重pcr的檢測方法(amiris.,subbotins.a.,moensm.,anefficientmethodforidentificationoftheheteroderaschachtiisensustrictogroupusingpcrwithspecificprimers.nematol.medit.2001,29:241-246)。subbotinsa,pengdl,moensm.運用雙重pcr檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個pcr反應體系中同時運用通用引物d3a和d3b以及特異性引物glyf1和rdna2，從52個大豆孢囊線蟲群體中均擴增出兩個dna片斷(181bpand345bp)，檢測的敏感度高達單個孢囊、單頭二齡幼蟲的微量dna(subbotons.a.,pengdl,moensm.,arapidmethodfortheidentificationofthesoybeancystnematodeheteroderaglycinesusingduplexpcr.nematology2001,vol.3(4):365-371)。

國內外已經有關于旱稻孢囊線蟲pcr快速檢測技術研究。彭德良等根據旱稻孢囊線蟲特異性rapd擴增片段，設計特異性scar標記引物hef1和her1，可擴增出434bp的特異性片段(發明專利：旱稻孢囊線蟲旱稻孢囊線蟲特異性rapd和scar標記快速分子檢測方法-cn201210200140.4)；丁中等根據旱稻孢囊線蟲its序列開發出特異性檢測旱稻孢囊線蟲的pcr方法，該特異性引物可在旱稻孢囊線蟲群體特異性擴增出281bp的片段，其靈敏度達1/256條2齡幼蟲(發明專利特異性檢測旱稻孢囊線蟲的pcr方法-cn201210322051.7)。

循環恒溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplificationofdna，lamp)是2000年日本榮研株式會社notomi等人開發的一種新型循環恒溫核酸擴增技術。(notomit，okayamah，masubuchih，yonekawat,watanabek,aminonandhaset.loop-mediatedisothermalamplificationofdna[j].nucleicacidsres，2000，28(12):e63.)，該技術通過識別靶序列上6個特異區域的特異性引物和利用具有鏈置換功能的bstdna聚合酶，在恒溫條件下能特異、高敏、快速地擴增靶序列。2008年日本科學家首次利用lamp技術建立了從病木中直接檢測松材線蟲lamp檢測的方法(kikuchit,aikawat,oeday,karimn,kanzakin.arapidandprecisediagnosticmethodfordetectingthepinewoodnematodebursaphelenchusxylophilusbyloop-mediatedisothermalamplification.nematology,2009,12:1365-1369)。隨后在建立了南方根結線蟲、象耳豆根結線蟲、北方根結線蟲、香蕉穿孔線蟲、柑橘半穿刺線蟲等重要病原線蟲的lamp檢測技術(niujh,guoqx,jianh,chencl,yangd,liuq,guoyd.rapiddetectionofmeloidogynespp.bylampassayinsoilandroots.cropprotection,2011,8:1063-1069；niujh,jianh,guoqx,chencl,wangxy,liuq,guoyd.evaluationofloop-mediatedisothermalamplification(lamp)assaysbasedon5srdna-igs2regionsfordetectingmeloidogyneenterolobii.plantpathology,2011,02562.x；pengh,pengdl,huxq,hexf,wangq,huangwk,hewt.loop-mediatedisothermalamplificationforrapidandprecisedetectionoftheburrowingnematode,radopholussimilis,directlyfromdiseasedplanttissues.nematology，2012,14(8):977-986.)靈敏度比常規pcr檢測高10-100倍。lamp檢測技術在旱稻孢囊線蟲上尚無相關報道，本發明首次建立了旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測方法。

技術實現要素：

本發明的目的是建立循環恒溫擴增技術(lamp)檢測旱稻孢囊線蟲的lamp快速檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性強等特點，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用，也適合在實驗條件不足的室外檢測。

一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測方法，其特征在于：其中lamp反應體系所使用的引物是：

1)he-f3：5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3：5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip：5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip：5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb：5’-aggttggagctgggatgcg-3’

其中的he-fip采用熒光基團標記，5`段采用生物素標記。

其中的lamp反應體系包括：

(1)引物混合液：外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環引物he-lb為0.4μmol/l；

(2)反應混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；

(3)1μldna模板；

加滅菌雙蒸餾水補全到25μl。

其中lamp反應條件如下：將引物混合液和反應混合液混合均勻后加入1μldna模板，61～65℃溫育30～90min，85℃保溫5min。

還包括lamp反應后的鑒定步驟，所述鑒定步驟包括顯色鑒定或電泳圖鑒定。

所述顯色鑒定為在擴增反應產物中加入的顯色劑為100倍sybrgreeni，以肉眼觀察顯色結果，顯綠色熒光的為旱稻孢囊線蟲。

所述電泳圖鑒定為電泳圖顯示為梯形條帶的為旱稻孢囊線蟲。

所述電泳圖鑒定為在擴增反應產物中加入探針，雜交后，插入lfd試紙，發現同時存在測試帶和控制帶，所述探針的序列為：

he-probe：5-cgccgaggttggagctgggatgc-3`，

所述探針5`段采用fitc標記。

上述任一檢測方法在旱稻孢囊線蟲早期診斷和輔助鑒定中應用。

本發明利用循環恒溫擴增技術建立針對旱稻孢囊線蟲的lamp檢測方法。本方法具有多條引物的擴增，并在兩端形成了帶有引物功能的環狀結構，這種多引物結合和可自產生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強等特點，由于lamp反應操作步驟簡單及反應產物經熒光顯色后，結果可以通過肉眼直接判定，適用于各種實驗條件下檢測工作的使用,特別適合在實驗條件不足的室外檢測。

本發明的方案具體實施步驟如下：

1.dna的提取

挑取單個旱稻孢囊放入裝有10μlddh2o的0.2ml離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μl的10倍pcr緩沖液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷凍30min。將離心管取出，在65℃下溫育90min，95℃反應10min處理后上清液作為線蟲dna模板直接用于lamp和pcr反應。

2.旱稻孢囊線蟲lamp引物設計

根據ncbi中旱稻孢囊線蟲its-rdna序列(genbank登錄號：jn_257082,kc_618466,kf_430213andkm_017067)及其近源種heteroderaoryzicola(af_274387)、h.cyperi(af_274388)、h.mothi(af_498392)等its序列，通過比對后，選擇旱稻孢囊線蟲特異區域，采用primerexplorerv4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html).在線軟件設計、實驗篩選出以下5條特意性強，穩定性高的引物，序列如下:

1)he-f3:5’-gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

3.lamp反應體系配置

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環引物he-lb為0.4μmol/l；反應混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgso4,10mmol/l(nh4)2so4,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25μl。

lamp反應條件如下：將引物混合液和反應混合液混合均勻后加入1μldna模板，61～65℃溫育30～90min，85℃保溫5min。

lamp結果結果可以采用以下三種檢測方法：

1)將上述反應完的體系中加入1μl的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；

2)取2μl擴增產物在2％瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；

3)擴增產物種加入1μlfitc標記的探針(10μm)，65℃保溫5min后，自然冷卻至室溫，取10ul雜交液，加入到100μlofbps緩沖液中，插入一根lfd試紙，靜置5-15min觀察。4.結果觀察

在最佳反應體系和反應條件下，旱稻孢囊線蟲陽性反應的凝膠電泳能夠觀察到典型的階梯狀條帶。此外，加入sybrgreeni染色劑后，肉眼可以觀察到lamp產物變成綠色，且在側向層析監測中，測試線和對照線均出現條帶。而使用其他種線蟲dna進行lamp無法得到陽性結果，表明lamp方法準確度高；本發明lamp檢測體系能夠檢測到1/20000頭旱稻孢囊線蟲，比常規pcr檢測靈敏10倍，具有極高的靈敏度。

綜上所述，本發明比現有的檢測旱稻孢囊線蟲方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產中進行現場應用檢測。該技術可應用于對旱稻孢囊線蟲田間土壤樣品及小麥孢囊線蟲病的發生早期快速分子檢測，具有實際的應用價值。

附圖說明

圖1為旱稻孢囊線蟲lamp引物設計示意圖，

圖2為旱稻孢囊線蟲lamp方法檢測，

a為加熒光染料檢測結果，1，2：陽性結果，具有綠色熒光，3：陰性對照，為棕色。

b檢測結果為電泳圖，m:100bpdna標準分子量；1，2：陽性結果，為lamp擴增梯形條帶，3：陰性對照，無擴增產物。

c檢測結果為電泳圖，1，2：陽性結果同時具有控制線和測試線；3：陰性對照，只有控制線。

圖3為旱稻孢囊線蟲靈敏度檢測結果

a為lamp檢測電泳圖，m：1000dna標準分子量，單頭孢囊，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和陰性對照(ck)。

b為普通pcr法檢測電泳圖，m：100dna標準分子量，，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4個孢囊及陰性對照(ck)。

圖4為旱稻孢囊線蟲lamp特異性檢測結果

1-7為旱稻孢囊線蟲(he01、he02、he03、he04、he05、he06、he07)，8-22分別為南方根結線蟲(mi01andmi02),象耳豆根結線蟲(me01),擬禾本科根結線蟲(mg01andmg02),北方根結線蟲m.hapla,爪哇根結線蟲(mj),花生根結線蟲(ma),水稻潛根線蟲(ho01andho02),h.mucronata,禾谷孢囊線蟲(ha),菲利普孢囊線蟲(hf),玉米短體線蟲(pz)和tylenchorhynchusannulatus(ta)；23-24為陰性對照。.

具體實施方式

下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。

所述試劑均為市售，所用測試線蟲本申請人實驗室均有保存，可以免費向公眾發放。

主要試劑：taqdna聚合酶購自天根公司；dnamarker購自takara公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；pgem-teasyvector購于美國promegaprok(蛋白酶k)購自roche公司；bstdna聚合酶大片段購自newenglandbiolabs公司；sybrgreeni購自invitrogen公司。

實施例1旱稻孢囊線蟲dna的提取、its擴增及序列分析

1.1旱稻孢囊線蟲dna的提取

挑取單個旱稻孢囊放入裝有10μlddh2o的0.2ml離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μl的10倍pcr緩沖液，2μl的600μg/ml蛋白酶k溶液，然后在-80℃下冷凍30min。將離心管取出，在65℃下溫育90min，95℃反應10min處理后上清液作為線蟲dna模板直接用于lamp和pcr反應。

1.2旱稻孢囊線蟲its片段擴增及序列分析

應用its通用引物tw81和ab28擴增旱稻孢囊線蟲its片段。pcr擴增反應體系為50μl，pcr反應體系為10×buffer(含mg²⁺)5μl，10mmdntp4μl，引物tw81和ab28(10μmol/l)各1μl，taq酶(5u/μl,takara)0.5μl，模板dna5μl，滅菌ddh2o補足至50μl。pcr擴增條件為：95℃預變性5min，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35個循環；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr擴增后，取5μl擴增產物加1μl加樣緩沖液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。

實施例2旱稻孢囊線蟲lamp檢測的建立

2.1lamp引物設計

根據旱稻孢囊線蟲its區域特異性片段的測序結果，設計并篩選下述lamp引物(見圖1)，引物交上海生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：

1)he-f3:5’gctctctgtccatgtcagga-3’

2)he-b3:5’-ccgcaactagcccaatgc-3’

3)he-fip5’-gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa-3’

4)he-bip5’-gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg-3’

5)he-lb5’-aggttggagctgggatgcg-3’

2.2lamp反應體系配置：

外引物he-f3和he-b3各0.2μmol/l，內引物he-fip和he-bip各1.4μmol/l,環引物he-lb為0.4μmol/l；反應混合液：3.2mmol/ldntp,20mmol/ltris-hcl(ph8.8),10mmol/lkcl,3mmol/lmgs04,10mmol/l(nh4)2s04,0.1％tritonx-100,8ubstdna大片段聚合酶；1μldna模板；加滅菌雙蒸餾水補全到25μl。

2.3lamp反應擴增條件：將以上混合液置于65℃恒溫水浴中等溫擴增45min，85℃保溫10min，反應結束后加入1μl配制好的顯色劑混勻后觀察結果(圖2-a)。取2μl產物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測并照相，可看到有lamp的特征性梯形帶(圖2-b)，加入探針雜交后，插入lfd試紙，發現同時存在測試帶和控制帶(圖2-c)。

實施例3旱稻孢囊線蟲lamp靈敏度檢測

將單頭旱稻普孢囊dna模板按10倍稀釋成1～1.0×10^-76個濃度，各取1μldna做模板，將上述的引物混合液和反應混合液混合均勻后，按2.3反應條件進行，反應結束后，取3μl產物在2％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色，在紫外燈下觀測并照相(圖4-a)，在2-5泳道均觀察到lamp的特征性梯形帶，說明dna稀釋1000倍后，仍能夠檢測，檢測靈敏度為1/20000頭線蟲。同時以上述稀釋dna為模板，以外側引物f3和b3為引物，進行常規pcr檢測，體系如下：2.5μl10×pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5μl10mmdntps，1μlf3和b3(10um)，0.3μltaqdna聚合酶(5u/ul)，1μl模板dna，滅菌ddh2o補足至25μl，采用無線蟲dna模板為陰性對照。pcr擴增條件為：95℃預變性5min，52℃退火30sec，72℃延伸1.5min；35個循環；72℃再次延伸10min，4℃保存。pcr擴增后，取5μl擴增產物加1μl加樣緩沖液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，eb染色后，凝膠電泳觀察結果(圖4-b)。結果表明在dna稀釋到10^-2倍時，能夠觀察到擴增條帶，10^-3和更低的濃度時常規pcr則不能檢測。

以上結果說明：上述lamp檢測體系能夠檢測到1/20000頭旱稻孢囊線蟲，比常規pcr檢測靈敏10倍，具有極高的靈敏度。

實施例4旱稻孢囊線蟲lamp特異性檢測

收集旱稻孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、爪哇根結線蟲、花生根結線蟲、北方根結線蟲、象耳豆根結線蟲、潛根線蟲短體線蟲等22個種群(見表1)，分別提取其dna作為模板與旱稻孢囊線蟲dna模板一起進行lamp檢測，以檢測旱稻孢囊線蟲lamp檢測方法的特異性。

表1供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源

上述引物混合液和反應緩沖混合液混合均勻后，加入1μl模板dna，按2.3的反應條件進行，反應結束后加入1μl配制好的顯色劑混勻后，觀察顏色變化。結果表明1-7管為旱稻孢囊線蟲dna，可以觀察到綠色熒光，其他植物線蟲和陰性對照為模板的反應均為紅褐色(圖4)。結果表明上述lamp引物和反應體系能夠特異性的檢測旱稻孢囊線蟲。

sequencelisting

<110>中國農業科學院植物保護研究所

<120>一種旱稻孢囊線蟲lamp快速檢測方法

<130>pp17088－zwb

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>he-f3序列

<400>1

gctctctgtccatgtcagga20

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>he-b3序列

<400>2

ccgcaactagcccaatgc18

<210>3

<211>38

<212>dna

<213>he-fip序列

<400>3

gcaggacagctgcccatgtggcggatcgttcgggagaa38

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>he-bip序列

<400>4

gcgcagcttgggatgcttttaccacaggcttacacttgtg40

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>he-lb序列

<400>5

aggttggagctgggatgcg19

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>he-probe序列

<400>6

cgccgaggttggagctgggatgc23