專利名稱：特異性檢測旱稻孢囊線蟲的pcr方法
技術領域：
本發明涉及植物寄生線蟲檢測領域，具體涉及以旱稻孢囊線蟲特異性引物檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法。
背景技術：
旱稻抱囊線蟲(Heterodera elachista ohshima, 1974)又稱日本抱囊線蟲(Japanese cyst nematode),最早由岡田1953年在日本櫪木縣山地稻田中發現。該病害在湖南省多個縣市的丘陵地帶稻田均有發生。該病害危害隱蔽，同缺肥、缺水癥狀相似，不造成特異性癥狀。該線蟲一般寄生在水稻根部，具有主動侵染寄生和自行轉移危害等特點，對水稻的危害，除吸取寄主的營養和對植物的根部造成損傷外，還能顯著降低水稻對水的利用效率，從而破壞植物的正常代謝和機能，影響生長和發育，致使植物的產量減少，品質下降。據報道，該線蟲在水稻上可造成7%-19%的損失。建立簡單快速檢測旱稻孢囊線蟲的方法有助于有效地進行旱稻孢囊線蟲的監測與防控。 在孢囊線蟲的鑒定與檢測方面，目前主要以傳統形態學鑒定為主，不僅需要豐富的知識經驗，而且往往會出現誤診的問題，同時形態鑒定耗時費力，需要專業人士操作，并且還需要從土壤中分離大量孢囊線蟲樣品，卻達不到快速從土壤分離的線蟲混合樣品或水稻根系中直接檢測出線蟲的水平。隨著分子生物學的發展，線蟲檢測鑒定技術取得了重大突破，線蟲的系統分類不再僅僅依靠形態學特征等傳統的方法，已探索出許多線蟲種群分類鑒定的分子診斷方法，利用分子技術探索不同種群rDNA的內轉錄間隔區(internal transcribed spacer, ITS)和rDNA28S的D2 / D3區的序列特征已成為近年來線蟲分子診斷的研究熱點。ITS序列是一個多用途的遺傳標記，位于18S和28S核糖體DNA基因的重復簇之間，中間被5. 8S核糖體DNA基因分開。研究ITS區域有很多優勢，尤其是在樣品較少而其它方法不能正確地鑒定線蟲時，分析rDNA-ITS區域的序列，可以更有效地鑒定和分辨更多的農業重要線蟲種或近緣種(Subbotin, et al，2001)。目前，國內外尚無基于旱稻孢囊線蟲的rDNA的ITS序列設計特異性引物檢測旱稻孢囊線蟲的報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法。為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，該方法是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進行PCR擴增，再電泳鑒定，該特異性引物為He-F :5’-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’，He-R :5，-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3，。
采用上述特異性引物進行PCR擴增，能擴增出旱稻孢囊線蟲281bp的片段。基于上述特異性引物，還可采用一步雙重PCR擴增進行檢測，即在PCR反應體系中加入通用引物D2A/D3B作內標D2A : 5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，D3B :5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’ ；可同時擴增出780bp和28Ibp的片段。對本發明方法詳細敘述如下一、特異性引物的設計
本發明人將旱稻孢囊線蟲的ITS序列及從NCBI基因庫下載的隸屬孢囊屬的6個近緣種(見下表I)的ITS序列進行比對分析，設計篩選出一對旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R。此對特異性引物的上游引物(He-F)位于ITS序列的第48bp至第72bp，下游引物(He-R)位于ITS序列的第304bp至328bp，擴增得特異性片段長度為281bp，該特異性引物序列如下He-F :5’ -ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’(如 SEQ ID NO 1 所示)，He-R :5’-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3’(如 SEQ ID NO :2 所示)。表I 6種孢囊線蟲及登錄號
Y~W^登錄號
擬水稻孢囊線蟲 H. oryzicolaAF274387
大豆孢囊線蟲H. glycinesHM560782
禾谷孢囊線蟲H. avenaeHM560737
菲利普孢囊線蟲H. FilipjeviHM147947
碗豆抱囊線蟲H. goettingianaAF498374
甘鹿抱囊線蟲H. sacchariAF274403將該特異性引物He-F/He-R分別經BLAST檢索，見表2和表3，結果表明，引物He-F/He-R的序列與檢索出現的旱稻孢囊線蟲的核苷酸序列均100%覆蓋。表2弓丨物He-F的BLAST結果
權利要求
1.一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于該方法是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進行PCR擴增，再電泳鑒定，該特異性引物為He-F :5’-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3’，He-R :5，-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3，。
2.如權利要求I所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于采用所述特異性引物進行PCR擴增，產生281bp的片段。
3.如權利要求I或2所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于所述PCR擴增采用的反應體系中還包括以下通用引物D2A :5’-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3’，D3B :5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’。
4.如權利要求3所述的特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，其特征在于所述PCR擴增同時產生780bp和281bp的片段。
全文摘要
一種特異性檢測旱稻孢囊線蟲的PCR方法，是以旱稻孢囊線蟲特異性引物He-F/He-R對待測樣品進行PCR擴增，再電泳鑒定，該特異性引物可在旱稻孢囊線蟲群體特異性擴增出281bp的片段，其靈敏度達1/256條2齡幼蟲。還可在PCR體系中加入通用引物D2A/D3B作內標，同時擴增出780bp的片段。本發明方法不僅可用于單個旱稻孢囊線蟲種孢囊和單條旱稻孢囊線蟲的2齡幼蟲的鑒定和檢測，還適用于土壤和水稻根樣中旱稻孢囊線蟲的檢測，本方法特異性強，靈敏度高，耗時短，操作簡單，在旱稻孢囊線蟲的檢測和旱稻孢囊線蟲病的早期診斷方面具有很高的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102796825SQ20121032205
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月3日 優先權日2012年9月3日
發明者丁中, 王水南, 何旭峰, 徐萍 申請人:湖南農業大學