本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種復合溶磷菌劑及其制備方法和應用。

背景技術：

磷是植物生長必需的營養物質之一，對于植物生長至關重要，但是土壤中的大部分有機磷和無機磷卻不能直接被植物吸收利用。我國74％的耕地土壤缺磷，且土壤中95％以上的磷為無效磷，造成有效磷資源的極度匱乏。施用磷肥可給植物提供磷素養分，但植物對磷肥的當季利用率一般只有5％～25％，由于耕地長期施用磷肥，大部分磷肥作為無效態在耕地土壤中積累，對生態環境造成影響。

土壤溶磷微生物不但能夠促進植物對各種營養元素的吸收，促進植株根系的生長，提高植物對磷的利用率，改善植物營養條件，提高作物產量，增加植株抗病能力，還可改善土壤結構，提高有機質含量，改良鹽堿地，對培育和充分發揮土壤生態肥力、保持農業生態環境具有重要作用。因此，土壤溶磷微生物的研究具有良好的發展前景和應用意義。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明的目的是提供一種復合溶磷菌劑，可以高效的將土壤中的無效磷轉換為可供小麥直接吸收的優質磷。

本發明提供了如下的技術方案：

本發明的復合溶磷菌劑，由溶磷菌ws32與溶磷菌p1616混合發酵制成，所述溶磷菌ws32的分類命名為假單胞菌(pseudomonassp.)，2017年6月9日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017319，保藏單位地址為武漢大學，所述溶磷菌p1616的分類命名為芽孢桿菌(bacillussp.)，2017年6月2日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2017298，保藏單位地址為武漢大學。

本發明菌株形態特征：溶磷菌ws32菌株為革蘭氏陰性菌，菌落整齊，呈淡黃色，接觸酶試驗顯示陰性，淀粉酶試驗顯示陽性；溶磷菌p1616為革蘭氏陽性菌，菌落不整齊，呈白色，有芽孢，接觸酶試驗顯示陽性，淀粉酶試驗顯示陽性。

本發明復合溶磷菌劑為液態復合溶磷菌劑或者固態復合溶磷菌劑。

本發明液態復合溶磷菌劑的制備方法如下，

將溶磷菌ws32和溶磷菌p1616的菌液按1：0.5～2的體積比混合，其中兩種菌液中的菌數均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內，然后將混合的菌液以2～5％的接種量接入80～120ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在25～30℃、120～180r/min的條件下，震蕩培養18～48h，即制得液態復合溶磷菌劑。

本發明固態復合溶磷菌劑的制備方法如下，

在上述液態復合溶磷菌劑中加入干燥的泥炭60～180g混勻，即制得固態復合溶磷菌劑。

本發明的液態復合溶磷菌劑中溶磷菌ws32和溶磷菌p1616的總菌數為1×10⁸～9×10⁸cfu/ml。

本發明復合溶磷菌劑在促進小麥的生長、促進小麥對磷素吸收以及降低化肥使用量的應用。

本發明復合溶磷菌劑用于小麥的拌種或包衣或澆根或蘸根。

本發明液態復合溶磷菌劑每畝小麥田施用量為1～4l，固態復合溶磷菌劑每畝小麥田施用量為1～4kg。

ws32的16srrna如seqidno.1所示，p1616的16srrna如seqidno.2所示。

本發明的有益效果是：

1、本發明的ws32和p1616與小麥具有親和性，可與小麥凝集素發生凝集反應，可在小麥根部長期定居存活，發揮促進小麥生長的作用。

2、本發明的復合菌劑具有強的產有機酸和磷酸酶能力，保證高效溶磷、解磷效果。

3、采用本發明的ws32和p1616制備的液態復合溶磷菌劑或固態復合溶磷菌劑具有顯著的溶磷效果，既能溶解難溶態無機磷，又能降解難溶態有機磷，利用ws32和p1616自身的代謝能力將不溶態的無機磷素和有機磷素釋放出來，大幅度提高菌液中或土壤中速效性磷的含量。

4、本發明的復合溶磷菌劑使用方法簡單，可采用拌種、包衣、澆根、蘸根等方法進行接種。

5、本發明的液態復合溶磷菌劑或固態復合溶磷菌劑的施用劑量低，液態復合溶磷菌劑每畝小麥田施用量僅為1～4l，固態復合溶磷菌劑每畝小麥田施用量僅為1～4kg，與其它每畝小麥田施用量為30～50kg的大劑量的生物肥料產品相比較，本發明可大幅度降低生產成本，節能環保。

附圖說明

圖1是難溶性無機磷磷酸三鈣培養基發酵液中可溶性磷濃度；

圖2是難溶性有機磷植酸鈣培養基發酵液中溶磷菌產酸性磷酸酶活性

圖3是ws32的菌落圖；

圖4是p1616的菌落圖；

圖5是ws32與p1616菌液體積比為1:1的菌落圖；

圖6是ws32與p1616菌液體積比為1:2的菌落圖；

圖7是ws32與p1616菌液體積比為2:1的菌落圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做具體說明。

實施例1ws32菌株與p1616菌株的篩選

采用選擇培養基結合凝集素篩選法從小麥根際篩選出與小麥具有特異親和作用的小麥根際溶磷菌29株；選用不同的溶磷培養基，分別添加ca3(po4)2、fepo4、alpo4、cahpo4·2h2o等難溶性無機磷，以及卵磷脂、植酸鈣等難溶性有機磷；采用鉬銻抗比色法測定各菌株發酵液中可溶性磷的濃度，測定29株菌株對不同形態難溶磷的溶解能力，確定其中5株菌溶磷效果較好。將這5株小麥高效溶磷菌分別以不同比例兩兩混合培養，測定其溶磷能力，發現其中ws32菌株與p1616菌株溶磷效果最佳，將兩株菌經16srrna分子測序確定ws32為假單胞菌屬，p1616為芽孢桿菌屬。

實施例2復合溶磷菌劑的溶磷能力

將ws32和p1616菌液分別按體積比1：0、0：1、2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內，以3％的接種量接入磷酸三鈣培養基，三角瓶培養，培養條件為160r/min、28℃、培養9天；采用鉬銻抗比色法每天定時測定發酵液中可溶性磷的濃度，結果如圖1所示，圖1中，w:p表示ws32：p1616，復合溶磷菌較單菌株的溶磷效果大大提高。

實施例3復合溶磷菌劑分泌有機酸和磷酸酶能力

(1)溶磷菌解無機磷原理為分泌有機酸，溶解土壤中難溶態無機磷為可溶態磷，供植物吸收利用。

采用磷酸三鈣培養基，高效液相色譜法測有機酸種類和濃度。液體搖瓶培養7d，取菌液1ml，離心，再經0.22μm濾膜真空抽濾后上液相色譜。分離條件：色譜柱為hypersilc18(250nm×4.6mmid，5μm)，流動相為0.02mol/l的kh2po4緩沖溶液-甲醇溶液(99％:1％)，用1mol/l磷酸調節ph至2.60，紫外檢測波長210nm，進樣量10μl，流速0.5ml/min，柱溫30℃，得到表1。

由表1可見，復合溶磷菌在磷酸三鈣培養基中產生的有機酸種類更多，濃度更大，有利于對難溶態無機磷的溶解。

表1高效液相色譜法對菌株分泌有機酸種類和濃度的測定

(2)溶磷菌解有機磷原理為產生磷酸酶，通過磷酸酶的酶降解作用，將土壤中的難溶性有機磷降解為有效磷。

對菌液中磷酸酶活性的測定采用植酸鈣培養基，磷酸苯二鈉法測定。結果如圖2所示。圖2中，w:p表示ws32：p1616，復合溶磷菌酸性磷酸酶活性最高，這加速了植酸鈣的分解，促進磷素釋放，從而提高小麥磷素營養。

實施例4液態溶磷菌劑的制備以及用于小麥的盆栽實驗

液態溶磷菌劑包括液態復合溶磷菌劑、液態ws32溶磷菌劑和液態p1616溶磷菌劑。

液態復合溶磷菌劑的制備

將ws32和p1616菌液分別按體積比2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內，并以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，即制得液態復合溶磷菌劑。

液態ws32溶磷菌劑的制備

將ws32(菌液中的菌數在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內)以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，即制得液態ws32溶磷菌劑。

液態p1616溶磷菌劑的制備

將p1616(菌液中的菌數在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內)以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，即制得液態p1616溶磷菌劑。

液態溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

小麥種子催芽，取適量小麥種子用水沖洗一次，然后用70％酒精浸泡3min消毒并去除干癟種子，再用無菌水沖洗5次，最后用適量的水浸泡，放于25℃培養箱中催芽，待種子露白即可播種。小麥盆栽設3個處理組和1個對照組：即施液態復合溶磷菌劑處理組(ws32和p1616菌液體積比分別為2:1，1:1，1:2)、施液態ws32溶磷菌劑處理組、施液態p1616溶磷菌劑處理組和施空白培養基對照組。每個處理組三個重復樣。處理組每盆接種液態溶磷菌劑5ml，對照組只接進5ml空白培養基，待苗出齊后每盆定苗5株，日常管理水肥，于125d采收，測定小麥株高、鮮重、干重、地上部分葉片磷含量及盆栽后土壤的磷含量。

試驗結果如表2所示：

液態復合溶磷菌劑接種的小麥株高、鮮重、干重、土壤速效磷含量、葉片全磷含量分別較未接液態菌劑的對照增加6.1％～25.6％、6.9％～8.9％、15.1％～19.3％、8.3％～14.8％、37.8％～49.7％，各參數較單菌劑接種的小麥也有較大幅度提高。證明了施用液態復合溶磷菌劑能夠提高小麥對磷的吸收，促進小麥生長。

表2液態溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

實施例5固態溶磷菌劑的制備以及用于小麥的盆栽實驗

固態溶磷菌劑包括固態復合溶磷菌劑、固態ws32溶磷菌劑和固態p1616溶磷菌劑。

固態復合溶磷菌劑的制備

將ws32和p1616菌液分別按體積比2：1、1：1、1：2混合，其中兩種菌液中的菌數均在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內，并以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態復合溶磷菌劑。

固態ws32溶磷菌劑的制備

將ws32(菌液中的菌數在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內)以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態ws32溶磷菌劑。

固態p1616溶磷菌劑的制備

將p1616(菌液中的菌數在1×10⁸～9×10⁸cfu/ml范圍內)以3％的接種量接入100ml牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在28℃、160r/min條件下，震蕩培養30h，加入干燥的泥炭150g混勻，即制得固態p1616溶磷菌劑。

固態溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

本實施例的小麥的盆栽實驗與實施例4的小麥的盆栽實驗不同之處在于，實施例4的小麥的盆栽實驗“處理組每盆接種液態溶磷菌劑5ml，對照組只接進5ml空白培養基”，本實施例的小麥的盆栽實驗“每盆接種固態溶磷菌劑5g，對照組接入經121℃、20min滅活處理的固態溶磷菌劑5g”。

試驗結果如表3所示

固態復合菌劑接種的小麥株高、鮮重、干重、葉片全磷含量分別較未接菌劑的對照增加6.3％～12.7％、7.6％～9.3％、13.1％～16.7％、42.5％～52.9％，各參數較單菌劑接種的小麥也有較大幅度提高。證明了施用固態復合溶磷菌劑能夠提高小麥對磷的吸收，促進小麥生長。

表3固態溶磷菌劑用于小麥的盆栽實驗

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>安徽農業大學

<120>一種復合溶磷菌劑及其制備方法和應用

<130>2

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<213>假單胞菌（pseudomonassp.）

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<213>芽孢桿菌（bacillussp.）

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