本發明屬于分子生物學及基因工程領域，具體涉及一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法。
背景技術：
：木聚糖是植物細胞壁半纖維素的主要成分，是自然界中第二大含量豐富的可再生資源。木聚糖酶能夠將木聚糖水解為低聚木糖及木糖，根據木聚糖酶的作用方式可將木聚糖酶分為β-1,4-內切木聚糖酶，β-木糖苷酶，α-葡萄糖醛酸苷酶，α-l-呋喃型阿拉伯糖苷酶等。β-1,4-內切木聚糖酶能夠水解木聚糖主鏈的β-1,4糖苷鍵，產生低聚木糖和少量木糖，是降解木聚糖的關鍵酶。由于β-1,4-內切木聚糖酶能夠有效的水解木聚糖主鏈的β-1,4糖苷鍵，使其在飼料、造紙等工業領域具有巨大的應用潛力。目前限制β-1,4-內切木聚糖酶在飼料、造紙等工業領域產業化應用的主要因素是耐熱性能差、生產成本高。飼料及造紙等工業領域均涉及到高溫加工環節，普通的β-1,4-內切木聚糖酶經過高溫環節后，酶容易變性失活，不能發揮作用。因此篩選及高效表達高溫耐熱β-1,4-內切木聚糖酶可以有效的推動β-1,4-內切木聚糖酶在飼料、造紙等工業領域的產業化應用。中國專利申請(cn103602645a)公開了一種木聚糖酶的制備方法，木聚糖酶的制備方法，包括下述步驟：活化菌種：用ypd培養基，對含有耐熱木聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌進行活化，活化條件為28～32℃，20～26h，所述的ypd培養基為酵母浸出粉胨葡萄糖培養基；擴大培養：將活化好的菌種接入搖瓶中，于28～32℃下，以180～220r/min的轉速進行擴大培養；二次擴大培養：22～26h后接入種子罐，28～32℃條件下進一步擴大培養；發酵：經種子罐擴大培養后，接入發酵罐，28-32℃下，ph4.6～4.8條件下進行發酵，140～160h后發酵結束；過濾：將發酵結束的料液，加入1％的硅藻土，混合均勻后，打入板框壓濾機進行過濾，過濾壓力<0.5mpa；超濾濃縮：過濾澄清后，用膜分子量10000da的有機膜進行超濾濃縮，濃縮至所需要的酶活；加入防腐劑，所述的防腐劑包括鹽和山梨酸鉀；鹽的濃度為8-12％，山梨酸鉀的濃度為1-3‰；加入上述的防腐劑后，與濾液混合均勻，在小于0.5mpa的壓力下，精濾、除菌，灌裝。其發酵得到的木聚糖酶的酶活依舊需要提高。技術實現要素：為解決上述問題，本發明提供了一種重組耐熱木聚糖酶tx的制備方法。本發明通過密碼子優化技術優化了來源于嗜熱細菌thermotogapetrophilarku的β-1,4-內切木聚糖酶基因tx，將優化后的tx基因轉入畢赤酵母得到了表達耐熱β-1,4-內切木聚糖酶tx的重組工程菌。最后通過高密度發酵技術，實現了耐熱木聚糖酶tx的高效表達，為其產業化應用奠定基礎。本發明通過以下技術方案實現：一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法，包括以下步驟：s1.根據畢赤酵母密碼子偏好性，對來源于嗜熱細菌thermotogapetrophilarku耐熱木聚糖酶基因tx進行優化，優化后的耐熱木聚糖酶基因tx序列如seqidno.1；s2.合成步驟s1中優化后的耐熱木聚糖酶基因tx，構建重組表達載體，將構建成功的重組表達載體轉入畢赤酵母得到重組工程菌株，然后進行高酶活轉化子篩選；s3.將篩選出來的高酶活轉化子進行高密度發酵，即得。優選地，步驟s2中表達載體為ppiczαa或ppic9k。優選地，步驟s3高密度發酵步驟為：i.種子培養液制備：將篩選得到的高酶活轉化子接種于100mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養20h進行活化，取活化的菌液以1:50的比例接種到300mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養至od600＝5；ii.向發酵罐中加入20l發酵基礎培養基，121℃滅菌20min，調節溫度至30℃，用氨水調節ph值至5.0，加入4.35ml/lptml，按體積比1:10接入種子培養液；發酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在500-800rpm，溶氧維持在20％以上；iii.培養20～30h后，用氨水或磷酸調節ph值至4.5～7.0，培養溫度為24～32℃，流加100％甲醇進行誘導培養，誘導培養144～192h后，收集發酵液，進行濃縮、純化即得。進一步地，高密度發酵步驟ii中，加入種子培養液16～24h后至發酵罐中甘油耗盡，補加含有12ml/lptm1的50％甘油，補料速度為18ml/l·h，持續補加4～6h。進一步地，高密度發酵步驟iii：培養20～30h后，用磷酸調節ph值至5.5，溫度為26℃，流加100％甲醇進行誘導培養并補加ptml，誘導培養168h后，收集發酵液，進行濃縮、純化即得。本發明制備方法用到的相關培養基具體如下：大腸桿菌培養基為lb：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0；lb-amp培養基：lb培養基加100μg/ml氨芐青霉素；lb-zeo培養基：lb培養基加25μg/mlzeocin；畢赤酵母種子培養基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；酵母篩選培養基為ypdzeo：ypd+100mg/lzeocin；酵母誘導培養基bmgy：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v)；bmmy培養基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與bmgy相同；重組酵母發酵培養基本鹽培養基：磷酸氫二銨5％、磷酸二氫鉀0.5％、七水硫酸鎂1.5％、硫酸鉀1.95％、硫酸鈣0.1％、氫氧化鉀0.1％、消泡劑0.03％，高壓后每升加4.35毫升ptm1；ptm1(微量鹽溶液)：硫酸銅0.6％、碘化鉀0.018％、一水硫酸錳0.3％、二水鉬酸鈉0.02％、硼酸0.002％、六水氯化鈷0.05％、氯化鋅2％、七水硫酸鐵6.5％、濃硫酸0.5％、生物素0.02％。由實驗結果可知，本發明方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶在ph5-10范圍內具有很好的穩定性，剩余酶活均大于83％；同時也具有很好的熱穩定性，當處理溫度為100℃時，剩余酶活可達到81％。附圖說明圖1：優化前和優化后tx基因序列比對；圖2：重組耐熱木聚糖酶tx的最適ph及ph穩定性；圖3：重組耐熱木聚糖酶tx的最適反應溫度及溫度穩定性。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本發明，但并不因此限制本發明。以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。大腸桿菌菌株topl0，畢赤酵母以及表達載體ppiczαa和ppic9k均由本司實驗室保存。實施例1不同培養基制備按下述配方，進行不同培養基的制備：大腸桿菌培養基為lb：1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0。lb-amp培養基：lb培養基加100μg/ml氨芐青霉素；lb-zeo培養基：lb培養基加25μg/mlzeocin；畢赤酵母種子培養基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；酵母篩選培養基為ypdzeo：ypd+100mg/lzeocin；酵母誘導培養基bmgy：1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v)；bmmy培養基：以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與bmgy相同；重組酵母發酵培養基本鹽培養基：磷酸氫二銨5％、磷酸二氫鉀0.5％、七水硫酸鎂1.5％、硫酸鉀1.95％、硫酸鈣0.1％、氫氧化鉀0.1％和消泡劑0.03％；高壓后每升加4.35毫升ptm1；ptm1(微量鹽溶液)：硫酸銅0.6％、碘化鉀0.018％、一水硫酸錳0.3％、二水鉬酸鈉0.02％、硼酸0.002％、六水氯化鈷0.05％、氯化鋅2％、七水硫酸鐵6.5％、濃硫酸0.5％、生物素0.02％。實施例2一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法所述重組耐熱木聚糖酶的制備方法，包括以下步驟：s1.根據畢赤酵母密碼子偏好性，對耐熱木聚糖酶基因tx進行優化；針對畢赤酵母表達系統，通過在線軟件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)對不含信號肽的耐熱木聚糖酶基因tx的密碼子進行分析，找出低頻密碼子；根據找出的低頻密碼子通過軟件dna2.0software(http://www.dna20.com)對tx基因進行優化；優化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司進行合成；經過優化，tx基因的密碼子適應指數由0.78提升到0.88，gc含量由原來的43％提高到46％；堿基a，t，c和g均勻分布于優化后的tx基因，減少了at和gc富集區，利于tx基因在畢赤酵母的表達；優化后的tx基因與原始基因的相似性為76％，如圖1所示；s2.合成步驟s1中優化后的耐熱木聚糖酶基因tx，連接到表達載體ppiczαa構建重組表達載體ppiczαa-tx，將構建成功的ppiczαa-tx用限制性內切酶saci線性化后，轉入畢赤酵母得到重組工程菌株，然后進行高酶活轉化子篩選：將轉化子分別接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培養36h后，按體積分數1％的比例加入甲醇進行誘導培養，每24h取樣進行測定；s3.將篩選出來的高酶活轉化子進行高密度發酵，高密度發酵步驟為：i.種子培養液制備：將篩選得到的高酶活轉化子接種于100mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養20h進行活化，取活化的菌液以1:50的比例接種到300mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養至od600＝5；ii.向發酵罐中加入20l發酵基礎培養基，121℃滅菌20min，調節溫度至30℃，用氨水調節ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按體積比1:10接入種子培養液；發酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在500rpm，溶氧維持在20％以上；加入種子培養液20h后至發酵罐中甘油耗盡，補加含有12ml/lptm1的50％甘油，補料速度為18ml/l·h，持續補加5h；iii.培養30h后，用磷酸調節ph值至5.5，溫度為26℃，流加100％甲醇進行誘導培養并補加ptml，誘導培養168h后，收集發酵液，進行濃縮、純化即得。實施例3一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法所述重組耐熱木聚糖酶的制備方法，包括以下步驟：s1.根據畢赤酵母密碼子偏好性，對耐熱木聚糖酶基因tx進行優化；針對畢赤酵母表達系統，通過在線軟件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)對不含信號肽的耐熱木聚糖酶基因tx的密碼子進行分析，找出低頻密碼子；根據找出的低頻密碼子通過軟件dna2.0software(http://www.dna20.com)對tx基因進行優化；優化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司進行合成；經過優化，tx基因的密碼子適應指數由0.78提升到0.88，gc含量由原來的43％提高到46％；堿基a，t，c和g均勻分布于優化后的tx基因，減少了at和gc富集區，利于tx基因在畢赤酵母的表達；優化后的tx基因與原始基因的相似性為76％，如圖1所示；s2.合成步驟s1中優化后的耐熱木聚糖酶基因tx，連接到表達載體ppic9k構建重組表達載體ppic9k-tx，將構建成功的ppic9k-tx用限制性內切酶saci線性化后，轉入畢赤酵母得到重組工程菌株，然后進行高酶活轉化子篩選：將轉化子分別接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培養36h后，按體積分數1％的比例加入甲醇進行誘導培養，每24h取樣進行測定；s3.將篩選出來的高酶活轉化子進行高密度發酵，高密度發酵步驟為：i.種子培養液制備：將篩選得到的高酶活轉化子接種于100mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養20h進行活化，取活化的菌液以1:50的比例接種到300mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養至od600＝5；ii.向發酵罐中加入20l發酵基礎培養基，121℃滅菌20min，調節溫度至30℃，用氨水調節ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按體積比1:10接入種子培養液；發酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在500rpm，溶氧維持在20％以上；加入種子培養液16h后至發酵罐中甘油耗盡，補加含有12ml/lptm1的50％甘油，補料速度為18ml/l·h，持續補加4h；iii.培養20h后，用氨水或磷酸調節ph值至4.5，培養溫度為24℃，流加100％甲醇進行誘導培養并補加ptml，誘導培養144h后，收集發酵液，進行濃縮、純化即得。實施例4一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法所述重組耐熱木聚糖酶的制備方法，包括以下步驟：s1.根據畢赤酵母密碼子偏好性，對耐熱木聚糖酶基因tx進行優化；針對畢赤酵母表達系統，通過在線軟件graphicalcodonusageanalyser(http://gcua.schoedl.de/)對不含信號肽的耐熱木聚糖酶基因tx的密碼子進行分析，找出低頻密碼子；根據找出的低頻密碼子通過軟件dna2.0software(http://www.dna20.com)對tx基因進行優化；優化后的tx基因序列如seqidno.1所示，并由基因合成公司進行合成；經過優化，tx基因的密碼子適應指數由0.78提升到0.88，gc含量由原來的43％提高到46％；堿基a，t，c和g均勻分布于優化后的tx基因，減少了at和gc富集區，利于tx基因在畢赤酵母的表達；優化后的tx基因與原始基因的相似性為76％，如圖1所示；s2.合成步驟s1中優化后的耐熱木聚糖酶基因tx，連接到表達載體ppiczαa構建重組表達載體ppiczαa-tx，將構建成功的ppiczαa-tx用限制性內切酶saci線性化后，轉入畢赤酵母得到重組工程菌株，然后進行高酶活轉化子篩選：將轉化子分別接入含有1.4mlbmgy的24孔板中，30℃培養36h后，按體積分數1％的比例加入甲醇進行誘導培養，每24h取樣進行測定；s3.將篩選出來的高酶活轉化子進行高密度發酵，高密度發酵步驟為：i.種子培養液制備：將篩選得到的高酶活轉化子接種于100mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養20h進行活化，取活化的菌液以1:50的比例接種到300mlbmgy培養基中，30℃、240rpm培養至od600＝5；ii.向發酵罐中加入20l發酵基礎培養基，121℃滅菌20min，調節溫度至30℃，用氨水調節ph至5.0，加入4.35ml/lptml，按體積比1:10接入種子培養液；發酵過程中，溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm，轉速控制在800rpm，溶氧維持在20％以上；加入種子培養液20h后至發酵罐中甘油耗盡，補加含有12ml/l的50％甘油，補料速度為18ml/l·h，持續補加5h；加入種子培養液24h后至發酵罐中甘油耗盡，補加含有12ml/lptm1的50％甘油，補料速度為18ml/l·h，持續補加6h；iii.培養30h后，用氨水或磷酸調節ph值至7.0，培養溫度為32℃，流加100％甲醇進行誘導培養并補加ptml，誘導培養192h后，收集發酵液，進行濃縮、純化即得。對比例1一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法與實施例1的區別在于，耐熱木聚糖酶基因tx未經步驟s1進行密碼子優化，其它步驟均與實施例1類似。試驗例1重組耐熱木聚糖酶酶活測定1.試驗對象：分別按實施例2～4及對比例1～2制備方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx。2.試驗方法：吸取2ml經稀釋的酶液，加入到刻度試管中，90℃平衡5min，再加入5mldns試劑，電磁震蕩3s～5s，然后加入2ml木聚糖溶液，90℃保溫30min，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁震蕩3s～5s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度。吸取200μl經過適當稀釋的酶液，加入到刻度試管中，再加入2ml木聚糖溶液(已經過90℃平衡)，電磁震蕩3s～5s，90℃準確保溫30min。加入5mldns試劑，電磁震蕩3s～5s，以終止酶解反應。沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25ml，電磁震蕩3s～5s。以標準空白樣為空白對照，在540nm處測定吸光度。酶活定義為在90℃、ph為5.0的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位u。3.試驗結果：如表1所示表1重組耐熱木聚糖酶酶活組別酶活(u/ml)實施例217320實施例314200實施例416300對比例12240由表1可知，按實施例2～4制備得到的重組耐熱木聚糖酶均具有較高的酶活性；與對比例1相比，實施例2制備制備得到的重組耐熱木聚糖酶酶活提高了6.73倍，說明本發明重組耐熱木聚糖酶基因tx經過優化后，重組耐熱木聚糖酶表達量及酶活提高顯著。試驗例2重組耐熱木聚糖酶的最適反應ph及ph穩定性檢驗將按實施例2制備方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx進行最適反應ph實驗，結果如圖2所示。由圖2a可知，重組木聚糖酶tx的最適ph為5.0，在ph4-7范圍內相對酶活均高于63％。將按實施例2制備方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx分別在ph值為3～10條件下室溫處理3h后，然后按試驗例1方法測定酶活。實驗結果如圖2所示。由圖2b可知，按實施例2方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx在ph5-10范圍內具有很好的穩定性，剩余酶活均大于83％。試驗例3重組耐熱木聚糖酶的最適反應溫度及熱穩定性檢驗將按實施例2制備方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx進行最適反應溫度實驗，結果如圖3所示。由圖3a可知，重組木聚糖酶tx的最適反應溫度為90℃。將按實施例2制備方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx分別在30℃～100℃條件下處理2小時，然后按試驗例1方法測定酶活，實驗結果如圖3所示。由圖3可知，按實施例2方法制備得到的重組耐熱木聚糖酶tx具有很好的熱穩定性，當處理溫度為100℃時，剩余酶活可達到81％。sequencelisting<110>廣東溢多利生物科技股份有限公司<120>一種重組耐熱木聚糖酶的制備方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>987<212>dna<213>thermotogapetrophilarku<400>1tctcaaaacgtttccttgcgtgagttggccgagaagttgaatatctacattggttttgct60gctattaacaacttttggtctttgtccgacgccgagaagtatatggaggttgccagaaga120gagttcaacattttgactccagagaaccagatgaagtgggacaccatccatccagagcgt180gaccgttacaacttcactccagccgaaaagcacgtcgagttcgccgaggaaaacgacatg240atcgtccatggtcacacccttgtctggcacaaccaattgccaggttggatcaccggaaga300gagtggactaaggaggagttgttgaacgttttggaggaccacatcaagaccgtcgtttcc360cacttcaagggacgtgtcaagatctgggacgtcgtcaatgaagccgtttccgactctggt420acctaccgtgagtctgtctggtacaagactatcggtccagagtacatcgagaaggccttc480agatgggctaaggaggccgacccagatgccattttgatctacaacgattactctattgag540gaaattaacgctaagtccaactttgtttacaacatgattaaggagttgaaggagaagggt600gttccagtcgacggtatcggattccaaatgcatattgattacagaggattgaattacgat660tcttttagaagaaacttggagcgtttcgctaagttgggtttgcagatttacattactgag720atggacgttcgtatcccattgtccggttccgaggaatactacttgaagaagcaggccgag780gtctgtgctaagattttcgacatctgtttggacaatcctgccgtcaaggccattcagttc840tggggtttcaccgataaatactcctgggtcccaggtttcttcaagggttacggtaaggct900ttgttgtttgacgaaaactacaatccaaagccttgttactacgctattaaggaggttttg960gaaaaaaaaattgaagagagaaagtaa987當前第1頁12