本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫木聚糖酶xyn27及其基因和應用。

背景技術：

自然界中，半纖維素是植物細胞壁骨架木質纖維素的組成部分，是僅次于纖維素的第二大可再生資源；大量存在于廢棄農作物中，如秸稈、玉米、稻草等。因此，半纖維素的降解是廢棄農作物再利用的首要前提。由于半纖維素的組成較為復雜，是由戊糖、己糖和糖醛酸連接而成的異質多糖；因此半纖維素的降解需要多種酶的參與，例如水解β-1,4-木糖苷鍵的外切木聚糖酶、甘露聚糖酶、作用于阿拉伯木聚糖非還原性末端的α-l-阿拉伯呋喃糖酶、水解葡萄糖醛酸木聚糖的α-葡萄糖醛酸酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶等。

木聚糖是組成半纖維素的多種雜多糖中的最主要成分，因此，木聚糖的完全降解對于半纖維素的降解來說也是至關重要的因素。木聚糖的結構亦為復雜，除了d-吡喃木糖以β-1,4-糖苷鍵連接而成的主鏈骨架外，其主鏈吡喃環的2，3號位往往會被不同的側鏈基團如阿拉伯糖、4-o-甲基-d-葡萄糖醛酸、阿魏酸等取代，不同來源的木聚糖其側鏈組成不同。

與中、高溫木聚糖酶相比，低溫木聚糖酶具有更松散、柔順的分子結構，使其在自然條件下具有更低的活化能、km值及催化反應溫度。這些特點可以加強其對底物的親和力，提高底物利用率，從而降低能耗，縮短處理過程的時間；另外，利用低溫木聚糖酶在高溫條件下對熱敏感的特點，可以通過溫和的熱處理使其變性失活，從而控制酶水解程度，使產品品質不受影響。例如，在食品行業中，由于低溫酶在中溫下容易失活，在應用低溫酶達到最佳反應效果后,只需在中等溫度保持較短時間就可使酶失活,這樣不會因溫度高而破壞食品的風味。目前發現的多數木聚糖酶都是中溫木聚糖酶，其最適作用溫度在70-90℃；對低溫木聚糖酶的研究在理論和實際應用中都具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種能高效應用的低溫木聚糖酶，其最適溫度35℃，在10℃和0℃還有38.7％和10.8％的相對酶活性，在35℃處理1h可以保持70％以上的相對活性，具有良好的熱穩定性，是一種具有應用潛力的新的低溫木聚糖酶。

本發明還提供編碼上述低溫木聚糖酶基因，包含上述基因的重組載體，以及包含上述基因的重組菌株。

本發明從枝頂孢屬菌中分離得到一種新的低溫木聚糖酶xyn27。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種低溫木聚糖酶xyn27，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

而且，低溫木聚糖酶xyn27以1％櫸木木聚糖為底物，在離子濃度為5mmol時，mn²⁺、ca²⁺、zn²⁺酶活力提高至123.33％，129.13％和106.45％；在ni²⁺,fe²⁺,cu²⁺,fe³⁺存在的條件下，xyn27酶活力保持94.28％，89.98％，85.50％和70.93％的相對活力；在edta和sds中，xyn27仍可以保持93.23％和83.07％的相對活性。

一種低溫木聚糖酶xyn27編碼基因，核苷酸序列如seqidno.2所示。

包含低溫木聚糖酶xyn27編碼基因的重組載體。所述載體為ppic9-xyn27。

包含低溫木聚糖酶xyn27編碼基因的重組菌株。

一種制備低溫木聚糖酶xyn27的方法，所述方法包括以下步驟：

⑴用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

⑵培養重組菌株，誘導重組低溫木聚糖酶xyn27編碼基因表達；

⑶回收并純化所表達的低溫木聚糖酶xyn27。

低溫木聚糖酶xyn27在食品發酵中的應用。

本發明的優點和積極效果如下：

本發明的xyn27是一個低溫木聚糖酶，最適溫度35℃，最適ph值均為7.0，常溫下，在弱酸性和中性的范圍內均具有活性；同時具有良好的熱穩定性，以1％櫸木木聚糖為底物，測得其木聚糖酶活性在ph＝4.0-8.0的范圍內維持30％以上的酶活性；在35℃處理1h后活性具有70％以上的酶活力。

附圖說明

圖1重組木聚糖酶的蛋白純化圖，xyn27蛋白純化，m：蛋白marker；1：發酵液；2：鎳柱純化后的蛋白。

圖2重組木聚糖酶的最適ph。

圖3重組木聚糖酶的ph穩定性。

圖4重組木聚糖酶的最適溫度。

圖5重組木聚糖酶的熱穩定性。

圖6重組木聚糖酶的金屬離子穩定性。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護范圍。

本發明從枝頂孢屬菌中分離得到一種新的低溫木聚糖酶xyn27基因，同時提供該基因編譯的低溫木聚糖酶。

本發明提供了一種低溫木聚糖酶xyn27，其氨基酸序列如seqidno.1所示，如下。

mrshlttalpllaatplasaqinkwaqaaglmyfgsatdtpgqreraglettypqydailadndmfgsttptngqkwlftepeqgvfnftegditadlaaeqgkslrchalvwhsqlapwvettewtpetlteaitlhvntiaehykgrcyawdvvnealnedgtwresvfyevlgedyiklafrlaaeadpeaklyyndynierpggkvngtlrivemlqadgiridgvgmqahfvagdsptldeqieviesyaalgvevalteldvrlstlppteetlalqkedyknavgactqvdacigitmwdfydpfswvpytfegegaallwfedftvhpayygvlaalknatglcaskakrgtaqlfna

其中，該酶基因編碼366個氨基酸和一個終止密碼子，其中前20個氨基酸為信號肽，成熟的木聚糖酶xyn27的理論分子量為40.41kda。

本發明提供了編碼上述低溫木聚糖酶xyn27，具體地，該基因的基因組序列如seqidno.2所示。

本發明通過pcr的方法分離克隆了木聚糖酶xyn27，dna全序列分析結果表明，木聚糖酶xyn27全長1101bp。seqidno.2：

atgcgaagccatctcaccaccgccctgcccctgctggccgccacgccgctggcctcggcccagatcaacaagtgggcccaggctgctggcctcatgtactttggctcggccacggacacacccggccagcgtgagcgcgccggtctggagacgacctacccccagtacgacgccatcctcgccgacaatgacatgttcggctccacgacgcccaccaacgggcaaaagtggctctttaccgagccggagcagggcgtcttcaacttcaccgagggcgacatcaccgccgacctcgccgccgagcagggcaagagcctccgctgccacgccctcgtctggcactcgcagctcgccccctgggtcgagaccaccgagtggacgcctgagacgctcaccgaggccatcacgctgcacgtcaacaccattgccgagcactacaagggccggtgctacgcctgggacgtggtcaacgaggcgctcaacgaggacggcacctggcgcgagagcgtcttctacgaggttctcggcgaggactacatcaagctcgccttccgcctcgccgccgaggcggatcccgaggccaagctgtactacaacgactacaacatcgagcgccccggtggcaaggtcaacggcacgctgcgtattgtggagatgctccaggcggacggcatccgcatcgacggtgtcggtatgcaggcacactttgtcgccggcgactcccctaccctcgacgagcagattgaggtcattgaatcgtacgccgcgctcggcgtcgaggtcgccctcacggagctggacgtgagactgtccaccctcccccccaccgaggagaccctcgcactccagaaggaggactataagaacgccgtcggcgcctgtacccaggtcgatgcctgcatcggcatcaccatgtgggacttttacgaccccttcagctgggttccctacacctttgagggtgagggcgccgcgctgctttggttcgaggactttaccgtgcacccggcgtactatggtgtccttgccgcgctcaagaacgccacgggcctgtgcgcgagcaaggccaagcgcggcacggcgcagctgttcaacgcatag

在genbank中進行blast比對，該基因與來源于myceliophthorathermophilaatcc42464.(xm_003662144)氨基酸序列一致性為83％。說明xyn27是一種新的木聚糖酶。

本發明還提供了包含上述木聚糖酶xyn27的重組載體，命名為ppic9-xyn27。將本發明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的木聚糖酶基因插入到質粒ppic9上的ecori和noti限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于aox1啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒ppic9-xyn27。

本發明還提供了包含上述低溫木聚糖酶xyn27的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌，優選為重組菌株gs115/xyn27。

本發明還提供了一種制備低溫木聚糖酶xyn27的方法，包括以下步驟：

⑴用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

⑵培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；

⑶回收并純化所表達的木聚糖酶xyn27。

其中，優選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(pichiapastoris)gs115，得到重組菌株gs115/xyn27。

本發明涉及的具體步驟如下：

試驗材料和試劑

1、菌株及載體：本發明從枝頂孢屬菌13-4中分離得到一種新的低溫木聚糖酶xyn27。畢赤酵母表達載體ppic9及菌株gs115購自于invitrogen公司。

2、酶類及其它生化試劑：內切酶購自takara公司，連接酶購自invitrogen公司。購自sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

3、培養基：

⑴大腸桿菌培養基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl,ph7.0)。

⑵bmgy培養基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，1％甘油(v/v)。

⑶bmmy培養基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均與bmgy相同。

⑷nb培養基：0.3％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.6葡萄糖，1％nacl。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。

本發明的xyn27是一個低溫木聚糖酶，最適溫度35℃，最適ph值均為7.0，常溫下，在弱酸性和中性的范圍內均具有活性；同時具有良好的熱穩定性，以1％櫸木木聚糖為底物，測得其木聚糖酶活性在ph4.0-8.0的范圍內維持30％以上的酶活性；在35℃處理1h后活性具有70％以上的酶活力。

實施例1

枝頂孢屬菌木聚糖酶編碼基因xyn27的克隆

提取來源于土壤樣品的枝頂孢屬菌13-4基因組dna：

根據第10家木聚糖酶基因的保守區序列設計合成了簡并引物xynf，xynr。

以枝頂孢屬菌13-4總dna為模板進行touch-downpcr擴增。pcr反應參數為：94℃變性5min；然后94℃變性30sec，65-55℃退火45sec(每個循環降0.5度)，72℃延伸40sec10個循環，94℃變性30s，60℃退火45sec，72℃延伸1min，30個循環后72℃保溫10min。得到一約1101bp片段，將該片段回收后與pmd-19t載體相連并測序。

根據測序得到的核苷酸序列，設計上游和下游各三條tail-pcr特異性引物：設計方向為需要擴增的未知區域方向，sp2的位置設計在sp1的內側，sp3位于sp2的內側。每兩個引物之間的距離沒有嚴格規定，引物長度一般22-30nt，退火溫度在60-65℃。并將它們分別命名為usp1、usp2、usp3(上游特異性引物)，dsp1、dsp2、dsp3(下游特異性引物)見表1。

表1.木聚糖酶xyn27tail-pcr特異性引物

通過tail-pcr得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收后送金唯智公司測序。拼接后木聚糖酶xyn27基因全長1101bp，編碼366個氨基酸和一個終止密碼子。該基因所編碼的成熟蛋白的理論分子量為40.41kda。

實施例2

重組木聚糖酶xyn27的制備

將表達載體ppic9進行雙酶切(ecori+noti)，同時將編碼木聚糖酶的基因xyn27雙酶切(ecori+noti)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體ppic9連接，獲得含有木聚糖酶基因xyn27的重組質粒ppic-xyn27轉化畢赤酵母gs115，獲得重組畢赤酵母菌株gs115/xyn27。

取含有重組質粒的gs115菌株，接種于100mlbmgy培養液中，30℃250rpm振蕩培養48h后，離心收集菌體。然后于50mlbmmy培養基重懸，30℃250rpm振蕩培養。誘導48h后，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。通過鎳柱純化后，sds-page結果表明(圖1)，重組酶在畢赤酵母中得到了表達。測得其木聚糖酶比活為10.41u/mg。

實施例3

木聚糖酶的活性分析

具體方法如下：在0.9ml的ph6.0的1％(w/v)櫸木木聚糖底物中加入100μl酶液，在37℃反應10min后加入1.5mldns，煮5min終止反應，冰上放置10min后，室溫下測定od540的吸光值。1u定義為在最適條件下每分鐘釋放1μmol還原糖所需要的酶量，單位是u/ml。

實施例4

木聚糖酶xyn27的性質測定

1、木聚糖酶xyn27的最適ph和ph穩定性的測定方法如下：

將實施例2純化的重組木聚糖酶在不同的ph下進行酶促反應以測定其最適ph。以1％櫸木木聚糖為底物。緩沖溶液的緩沖梯度不同：0.2m甘氨酸-鹽酸ph1.0-3.0；0.2m磷酸氫二鈉-檸檬酸ph2.5-8.0；0.2mtris-鹽酸緩沖液，ph7.0-9.0；0.2m甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，ph9.0-12.0。900μl底物與緩沖液的混合溶液在35℃的反應條件下先預冷5min，加入100μl適當稀釋的酶液，混勻并準確反應10min，加入1.5mldns終止反應，冷卻至室溫后測定od540值。結果(圖2)表明，重組酶在以1％櫸木木聚糖為底物時的最適ph為7.0，在ph4.0-8.0之間有30％以上的相對酶活性。在重組酶于各種不同ph值的緩沖液中35℃，處理1h，再于ph7.0的緩沖液，35℃的條件下測定相對剩余酶活，以研究酶的ph穩定性。結果(圖3)表明，測得其木聚糖酶活性在ph3.0-9.0之間都很穩定，相對剩余酶活均在30％以上。

2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下：

木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應。熱穩定性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在35℃下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖4)表明酶活性最適溫度為35℃。酶的熱穩定性性試驗表明(圖5)，xyn27有良好的熱穩定性，在35℃下溫育60min，能保持70％以上的酶活

3、不同金屬離子化學試劑對xyn27酶活的影響測定如下：

在酶促反應體系中加入不同的金屬離子及化學試劑(圖6)，研究其對酶活性的影響，各種物質終濃度為5mmol/l。在35℃、ph7.0條件下測定酶活性。結果表明，以1％櫸木木聚糖為底物，大多數離子在濃度為5mmol時，對其酶活力都有一定程度的抑制作用。其中fe³⁺，fe²⁺,cu²⁺，k⁺能強烈抑制其活力，而mn²⁺、ca²⁺、zn²⁺明顯增強酶活力。

結果表明，以1％櫸木木聚糖為底物，在離子濃度為5mmol時，mn²⁺、ca²⁺、zn²⁺可以顯著提高酶活力，分別提升至123.33％，129.13％和106.45％；mg²⁺基本不影響酶活力；在ni²⁺,fe²⁺,cu²⁺,fe³⁺存在的條件下，xyn27仍可以保持94.28％，89.98％，85.50％和70.93％的相對活力；在edta和sds中，xyn27仍可以保持93.23％和83.07％的相對活性。與其他已經報道的低溫木聚糖酶相比，xyn27具有更強的離子耐受能力。

sequencelisting

<110>天津科技大學

<120>一種低溫木聚糖酶xyn27及其基因和應用

<130>2016-12-1

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<212>prt

<213>低溫木聚糖酶xyn27氨基酸序列

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151015

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<213>木聚糖酶xyn27全長基因

<400>2

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gtcgagaccaccgagtggacgcctgagacgctcaccgaggccatcacgctgcacgtcaac420

accattgccgagcactacaagggccggtgctacgcctgggacgtggtcaacgaggcgctc480

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aagctcgccttccgcctcgccgccgaggcggatcccgaggccaagctgtactacaacgac600

tacaacatcgagcgccccggtggcaaggtcaacggcacgctgcgtattgtggagatgctc660

caggcggacggcatccgcatcgacggtgtcggtatgcaggcacactttgtcgccggcgac720

tcccctaccctcgacgagcagattgaggtcattgaatcgtacgccgcgctcggcgtcgag780

gtcgccctcacggagctggacgtgagactgtccaccctcccccccaccgaggagaccctc840

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<213>引物xynr

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