背景技術：

1、癌癥是全世界死亡的主要原因。經典的癌癥療法(例如放療、化療和外科手術)可能會伴隨嚴重的副作用，包括因健康非癌細胞的殺傷而產生的副作用。相對于早期的療法，包括使用生物制劑綴合物的療法，較新的治療劑增強了細胞毒性藥物對腫瘤細胞的靶向性。

技術實現思路

1、本披露提供了技術，例如組合物及其使用和制造方法，以滿足癌癥領域的需求。例如，與經典的癌癥診斷或療法相反，可以設計靶向分子來增加例如成像或治療方式的特異性并降低毒性。例如，使用多肽遞送治療劑例如螯合劑和/或放射性核素(例如，α發射體)以將所述治療劑特異性靶向腫瘤微環境提供了對腫瘤細胞的針對性治療，并通過靶向例如腫瘤的治療劑避免或降低了對周圍健康組織的毒性風險。

2、與經典的癌癥療法相比，放射性核素療法更具靶向性且毒性較小。例如，放射性核素至腫瘤微環境的特異性地遞送允許放射向腫瘤組織的選擇性定向，有效殺傷惡性細胞，同時保留周圍的健康組織。例如，放射性核素可以采用靶向性分子，所述靶向性分子特異性地結合相對于非腫瘤細胞在腫瘤細胞表面上以增加的水平和/或密度表達的抗原。放射性核素與抗原陽性腫瘤細胞的結合將放射靶向這些細胞，而不靶向健康組織。全長抗體之前已作為靶向性部分被評估；然而，由于它們的大尺寸等考慮因素，全長抗體或甚至抗體片段(例如，比本文提供的多肽更大的片段)會具有幾個挑戰，例如腫瘤組織穿透差，以及挑戰例如周圍施用、制造和儲存，以及其他。因此，仍然需要特異性靶向腫瘤、特別是實體瘤的新方法。本披露提供了滿足此需求和其他需求的技術。除其他之外，本披露提供了包含多肽及其綴合物的組合物，與當前現有技術(例如抗體，例如抗體-藥物綴合物)相比，其具有改善的腫瘤穿透、降低的脫靶毒性和/或積累、以及改善的對連接素-4的親和力。

3、在一些方面，本披露提供了包含某些氨基酸序列的多肽。在一些實施例中，這些多肽以一定的親和力與連接素-4結合。在一些實施例中，本披露提供了包含氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列包含式i：cx1ydx2x3fftalx4x5lrgx6dicx7yix8x9x10fx11x12x13x14x15x16cix17eilx18x19lgcx20(seq?id?no:161)，其中x20是任選的包含-oh的氨基酸或羧基末端并且其中x1是d或e；x2是e或g；x3是q或e；x4是a、k或s；x5是a、r、q、k、s或cit；x6是a、d、g或s；x7是d、q、e、l、s或y；x8是q、l或s；x9是a、q、e、k；x10是a、q、k、s、y、oh-正亮氨酸或正亮氨酸；x11是a、n、q或s；x12是n、t或y；x13是l、y或v；x14是p或e；x15是a、d、q、g或k；x16是d、q、e、i或l；x17是q或e；x18是d、q或e；x19是n或q；并且x20，當作為氨基酸存在時是s。

4、在一些實施例中，x1是e；x2是e；x3是e；x4是k；x5是r；x6是g；x7是y；x8是q；x9是a；x10是s；x11是q；x12是y；x13是l；x14是p；x15是g；x16是l；x17是e；x18是d；x19是n；并且x20是s。

5、在一些實施例中，多肽進一步包括接頭、螯合劑和放射性核素中的一種或多種。在一些實施例中，接頭包含以下或由以下組成：peg4、peg、peg2、peg6、peg8、peg12、peg24的聚乙二醇(peg)接頭、酯接頭、酰胺接頭、馬來酰亞胺接頭、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(smcc)接頭、丙酸接頭、癸烯酸接頭、或(gly)n-(gglu)n-或(peg)n(其中n是1至10)、(gly)1-10、或其經由共價鍵的任何片段或組合。在一些實施例中，螯合劑包含以下或由以下組成：dota、dopa、大環配體(macropa)或冠(crown)。在一些實施例中，放射性核素選自ac-225、ga-68、in-111、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。在一些實施例中，當存在時，接頭附接至多肽的c末端。在一些實施例中，當存在時，螯合劑附接至多肽或接頭。在一些實施例中，當存在時，放射性核素附接至螯合劑。在一些實施例中，多肽包含一個或多個另外的n末端氨基酸。在一些實施例中，多肽在多肽的n末端和/或c末端包含一個或多個氨基酸。在一些實施例中，多肽是單體。在一些實施例中，多肽是二聚體、三聚體或四聚體。在一些實施例中，多肽包含與seq?id?no:78的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施例中，多肽包含與seq?id?no:1-158或177中任一個的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施例中，多肽包含以下或由以下組成：根據表1b的式iia-iio(seq?id?no:161-176)中任一個的共有序列，進一步包含根據表1c中所示的那些的取代。

6、在一些實施例中，本披露提供了包含小蛋白(m)、任選的接頭(l)、以及螯合劑(c)和放射性核素(r)中的一者或兩者的組合物，其由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r(其中x是1、2、3或4)中的一個或多個的式表示。在一些實施例中，m包含以下或由以下組成：選自seq?id?no:78或seq?id?no:1-77、79-158、177、161-176(包括如表1c中所示的氨基酸取代)中任一個或其功能變體或部分的序列。在一些實施例中，當l存在時，l包含以下或由以下組成：peg4、peg、peg2、peg6、peg8、peg12、peg24的聚乙二醇(peg)接頭、酯接頭、酰胺接頭、馬來酰亞胺接頭、纈氨酸-瓜氨酸接頭、腙接頭、n-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)接頭、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(smcc)接頭、基于乙烯基砜的接頭、丙酸接頭、癸烯酸接頭、或(gly)n-(gglu)n-或(peg)n(其中n是1至10)、(gly)1-10、或其經由共價鍵的任何片段或組合。在一些實施例中，當c存在時，c包含以下或由以下組成：

7、i)dota

8、

9、ii)冠

10、

11、iii)nopo，或

12、

13、iv)大環配體

14、

15、除其他之外，本披露提供了包含與一種或多種另外的組分綴合的靶向腫瘤微環境和/或腫瘤細胞的多肽(例如，小蛋白)的綴合物，所述另外的組分包括例如接頭、螯合劑和/或放射性核素(例如，α發射體)。在一些實施例中，此類綴合物用于治療表達靶標(例如，連接素-4)的細胞。在一些這樣的實施例中，細胞是癌細胞。

16、在一些實施例中，組合物包含接頭和螯合劑。

17、在一些實施例中，組合物包含接頭、螯合劑和放射性核素。

18、在一些實施例中，組合物包含小蛋白、任選的接頭、螯合劑和/或放射性核素。

19、在一些實施例中，組合物由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r中的一個或多個的式表示，其中m包含小蛋白(m)，l包含接頭(l)，c包含螯合劑(c)，r包含放射性核素(r)，且x是1、2、3或4，其中m包含結合連接素-4的小蛋白或其功能變體或部分。

20、在一些實施例中，根據本披露的多肽是使用固相肽合成方法制造的。在一些實施例中，多肽是重組的。在一些實施例中，多肽包含小蛋白或由小蛋白組成。在一些實施例中，小蛋白包含以下或由以下組成：半胱氨酸密集多肽、打結素、結合物、親和體、經工程改造的庫尼茨(kunitz)結構域、單抗體、抗運載蛋白(anticalin)、設計的錨蛋白重復結構域(darpin)或avimer。在一些實施例中，小蛋白包含以下或由以下組成：約100個或更少的氨基酸。在一些實施例中，小蛋白是半胱氨酸密集多肽。在一些實施例中，小蛋白包含至少一個半胱氨酸密集區。在一些實施例中，小蛋白的氨基酸序列包含至少兩個半胱氨酸(其可以形成至少一個二硫橋)。在一些實施例中，小蛋白包含一個或多個二硫橋。在一些實施例中，小蛋白的氨基酸序列包含至少三個半胱氨酸。在一些實施例中，小蛋白包含至少兩個二硫橋或由至少兩個二硫橋組成。在一些實施例中，小蛋白包含非二硫化物氨基酸序列或由非二硫化物氨基酸序列組成。在一些實施例中，小蛋白包含具有44-45個氨基酸的三個α螺旋。在一些這樣的實施例中，小蛋白具有約6kda或更小的摩爾質量。在一些實施例中，小蛋白在高溫和酸性或堿性條件下是穩定的。在一些實施例中，小蛋白包含衍生自脂質運載蛋白(lipocalin)的經工程改造的蛋白。在一些實施例中，小蛋白包含八鏈β-桶。在一些實施例中，小蛋白展示出(i)由于序列變異而導致的高結構可塑性和(ii)提高的構象柔性，從而允許誘導適應具有不同形狀的靶標。在一些實施例中，小蛋白包含一類抗體模擬物，其由兩個或更多個各自具有30至35個氨基酸的肽序列組成，這些肽序列衍生自各種膜受體的a結構域并且通過接頭肽連接。在一些實施例中，小蛋白包含衍生自錨蛋白的肽。在一些實施例中，小蛋白包含錨蛋白重復、由兩個α螺旋和一個β轉角組成的33殘基基序。在一些實施例中，小蛋白包含衍生自庫尼茨型蛋白酶抑制劑(例如牛胰腺胰蛋白酶抑制劑(bpti)、淀粉樣前體蛋白(app)或組織因子通路抑制劑(tfpi))的庫尼茨結構域的肽。在一些實施例中，小蛋白包含基于人纖連蛋白iii(10fn3)第10胞外結構域的分子，所述分子采用94個殘基的ig樣b夾心折疊，具有2至3個暴露的環，但缺乏中央二硫橋。

21、在一些實施例中，本披露提供了與包含全長蛋白或非小蛋白的蛋白的組合物相比具有各種優點的組合物。例如，在一些實施例中，本披露的組合物包含一種或多種選自以下的改善的特性：增加的蛋白表達、增加的熱活性、增加的熱穩定性、增加的ph活性、增加的穩定性、增加的活性、增加的受體結合特異性和/或親和力、增加的比活性、增加的對底物和/或終產物抑制的抗性、增加的化學穩定性、改善的化學選擇性、改善的溶劑穩定性、增加的對酸性ph的耐受性、增加的對蛋白水解活性的耐受性(例如，降低的對蛋白水解的敏感性)、減少的聚集、增加的溶解度和/或降低的免疫原性。

22、在一些實施例中，本披露的組合物特異性結合至細胞內、細胞上或細胞附近的靶標的至少一個表位。在一些實施例中，靶標是連接素-4。在一些實施例中，細胞是腫瘤細胞(其可能具有或可能不具有患有癌癥的特性，但衍生自腫瘤樣品)。在一些實施例中，細胞是癌細胞。在一些實施例中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞是原代細胞。在一些實施例中，原代細胞取自受試者的樣品(例如，來自活檢，例如，來自腫瘤)。在一些實施例中，細胞來自細胞系。

23、在一些實施例中，小蛋白或其綴合物選擇性結合靶標。在一些實施例中，靶標是在細胞表面上表達的蛋白或其部分。在一些實施例中，細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞是人細胞。在一些實施例中，細胞是癌細胞。在一些這樣的實施例中，癌細胞位于腫瘤中(即，是腫瘤的一部分)或附近。在一些實施例中，癌細胞是循環細胞。

24、在一些實施例中，靶標是細胞粘附受體、細胞因子受體、趨化因子受體、生長因子受體、免疫細胞受體或腫瘤相關的胞外基質多肽。在一些這樣的實施例中，靶標包含以下或由以下組成：連接素-4或其部分。

25、在一些實施例中，小蛋白或其片段可用于產生結合蛋白，例如特異性結合靶標上的至少一個表位的抗體(例如，重組抗體、多克隆、單克隆、單特異性、多特異性(例如，雙特異性、三特異性、四特異性等)、嵌合的、合成的、天然的、人源化的、移植的、全長抗體、抗體的抗原結合區(例如fab、fab’f(ab’)2、單鏈(fv、sfv、scfv、雙特異性scfv)、雙抗體、單鏈(例如，單重鏈、單輕鏈)、納米抗體、vhh等))。在一些實施例中，靶標是連接素-4。在一些實施例中，連接素-4是人連接素-4。在一些這樣的實施例中，這樣的抗體可以用于例如診斷性應用或阻斷性應用，等。

26、在相關方面，本披露提供了包含綴合物的藥物組合物。

27、在一些實施例中，綴合物包含小蛋白、接頭、螯合劑和放射性核素中的一種或多種。

28、在一些實施例中，使用載體(例如包含編碼多肽的核酸的重組表達載體)提供綴合物的一種或多種組分。

29、在一些實施例中，本披露提供了包含本文提供的分離的多核苷酸的載體。

30、在一些實施例中，本披露提供了包含編碼本文提供的綴合物的一種或多種組分的載體的宿主細胞。

31、在一些實施例中，本披露提供了能夠結合、調節和/或抑制連接素-4的組合物。在一些實施例中，連接素-4是人連接素-4。在一些實施例中，本披露的組合物是以下或包含以下：單克隆抗體療法、肽療法、肽受體放射性核素療法、免疫療法、放射免疫療法、基因療法或rna療法。

32、在一些實施例中，本披露的組合物被配制用于向有需要的受試者施用(例如，藥物組合物)。在一些實施例中，施用組合物用于治療一種或多種疾病、障礙或病癥。在一些實施例中，疾病、障礙或病癥是癌癥。在一些實施例中，治療包括提供組合物(例如通過施用，例如通過接觸細胞或細胞群體，例如腫瘤)，其中所述組合物包含特異性結合連接素-4的組分。在一些實施例中，連接素-4在細胞或細胞群上表達。在一些實施例中，提供組合物治療疾病、障礙或病癥。

33、在一些實施例中，本披露提供了調節連接素-4的方法。也就是說，在一些實施例中，調節連接素-4的生物活性的方法包括提供(例如通過施用，例如通過接觸細胞或細胞群體)包含有效調節連接素-4及其活性的量的一種或多種組分的組合物。例如，在一些實施例中，組合物包含特異性結合連接素-4的小蛋白以及接頭、螯合劑和/或放射性核素中的一種或多種。在一些這樣的實施例中，組合物結合表達連接素-4的細胞并將一種或多種療法(例如螯合劑，例如放射性核素)靶向表達連接素-4的細胞，例如，例如通過將組合物或其組分內化到細胞中。

34、在一些實施例中，本披露提供了能夠激活或抑制免疫細胞應答的方法和其中使用的組合物。在一些實施例中，施用提供的組合物用于治療癌癥。在一些實施例中，癌癥與連接素-4的表達或過表達相關。在一些實施例中，癌癥選自非小細胞肺癌(nsclc)、皮膚鱗狀細胞癌、胰腺癌、原發性肝細胞癌、結直腸癌、透明細胞腎癌、乳腺癌和前列腺癌。參見例如yang,shuo等人“連接素-4,a?checkpoint?molecule,as?a?target?for?cancerimmunotherapy.[連接素-4，一種檢查點分子，作為癌癥免疫療法的靶標]”internationaljournal?of?biological?sciences[國際生物科學雜志]卷16,11?1767-1773.2020年3月25日,doi:10.7150/ijbs.41105。

35、在一些實施例中，本披露提供了用于在檢測受試者中疾病、障礙或病癥的存在或程度中使用的方法和組合物。在一些實施例中，疾病、障礙或病癥是癌癥。在一些實施例中，受試者已被診斷患有癌癥。在一些實施例中，受試者被懷疑患有癌癥或有患癌癥的風險。在一些實施例中，診斷患有癌癥的受試者已經用一種或多種治療例如本文提供的組合物進行治療。在一些實施例中，檢測(例如，監測/確定預后、診斷等)的方法包括測量包含來自受試者(例如，使用基于細胞的測定)的一種或多種細胞的樣品中或受試者中(例如，使用體內掃描或測量)的靶標或特異性地結合靶標的小蛋白的水平。在一些這樣的實施例中，通過將水平與對照水平或與來自相同患者在不同時間點的水平進行比較，使用靶標或小蛋白的水平來確定受試者中癌癥的存在和/或程度。

36、在一些實施例中，本披露提供試劑盒。在一些這樣的實施例中，試劑盒包含一種或多種組分，例如小蛋白、接頭、螯合劑和/或放射性核素，其可以在一種或多種方法中組合以用于在結合靶標(例如，連接素-4)中使用。

37、在一些實施例中，本披露提供了包含小蛋白(m)、任選的接頭(l)、以及螯合劑(c)和放射性核素(r)中的一者或兩者的組合物，其由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r(其中x是1、2、3或4)中的一個或多個的式表示。在一些實施例中，m包含以下或由以下組成：半胱氨酸密集肽、打結素肽、結合物、親和體、經工程改造的庫尼茨(kunitz)結構域、單抗體、抗運載蛋白(anticalin)、設計的錨蛋白重復結構域(darpin)或avimer。在一些實施例中，結合物包含以下或由以下組成：線性多肽和/或非二硫化物序列。在一些實施例中，m的特征在于它包含(i)不超過1,000個氨基酸、900個氨基酸、800個氨基酸、700個氨基酸、600個氨基酸、500個氨基酸、400個氨基酸、300個氨基酸、200個氨基酸或100個氨基酸。在一些優選實施例中，m的特征在于它包含(i)不超過100個氨基酸和/或12kda；(ii)至少一個二級結構元件；(iii)隔離的疏水核心；和/或展示協同折疊。在一些實施例中，m包含不超過約100個氨基酸或更少、90個氨基酸、85個氨基酸、80個氨基酸、75個氨基酸、70個氨基酸、65個氨基酸、60個氨基酸、55個氨基酸、50個氨基酸、45個氨基酸、40個氨基酸、35個氨基酸、30個氨基酸、25個氨基酸、20個氨基酸、15個氨基酸、10個氨基酸或5個氨基酸。

38、在一些實施例中，小蛋白包含至少一個二硫橋。在一些實施例中，小蛋白包含零個、一個、兩個或更多個二硫鍵。在一些實施例中，小蛋白包含至少一個二硫橋。在一些實施例中，小蛋白的氨基酸序列包含至少三個半胱氨酸(c)氨基酸。在一些實施例中，小蛋白包含至少兩個二硫橋。

39、在一些實施例中，本披露提供了如l-c所示的組合物，其中l包含接頭或由接頭組成，c包含螯合劑或由螯合劑組成，并且其中接頭被設計為與多肽綴合。

40、在一些實施例中，本披露提供了如l-c-r所示的組合物，其中l包含接頭或由接頭組成，c包含螯合劑或由螯合劑組成，并且r包含放射性核素或由放射性核素組成，并且其中組合物能夠與小蛋白綴合。在一些實施例中，l當存在時包含以下或由以下組成：peg4、peg、peg2、peg6、peg8、peg12、peg24的聚乙二醇(peg)接頭、酯接頭、酰胺接頭、馬來酰亞胺接頭、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(smcc)接頭、丙酸接頭、癸烯酸接頭、或(gly)n-(γglu)n-或(peg)n(其中n是1至10)、(gly)1-10、或其經由共價鍵的任何片段或組合。在一些實施例中，c當存在時包含以下或由以下組成：

41、i)dota

42、

43、ii)冠

44、

45、iii)nopo，或

46、

47、iv)大環配體

48、

49、在一些實施例中，c當存在時包含以下或由以下組成：四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(dota)、冠、nopo或大環配體的衍生物。在一些實施例中，當l存在且c不存在時，l共價附接至m。在一些實施例中，r當存在時包含以下或由以下組成：ac-225、in-111、ga-68、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。在一些實施例中，組合物以1pm至100nm的親和力結合靶標，如通過體外結合測定所測量的。在一些實施例中，當m存在時，與靶標結合的小蛋白調節生物功能。在一些實施例中，當m存在時，m選擇性結合連接素-4或其部分。

50、在一些實施例中，本披露提供了包含小蛋白的組合物，所述小蛋白以約表1c中所示的親和力結合連接素-4。

51、在一些實施例中，本文提供的組合物包含小蛋白(m)，所述小蛋白包含選自seq?idno:1-158或177中任一個的氨基酸序列。在一些實施例中，組合物包含小蛋白(m)，所述小蛋白包含選自seq?id?no:161-176中任一個的氨基酸序列。在一些實施例中，m包含如表1c中所示在seq?id?no:161-176中任一個處的氨基酸取代。

52、在一些實施例中，本披露提供了包含分離的化合物或其藥學上可接受的鹽的組合物，這些組合物包含任選的接頭(l)，以及小蛋白(m)、螯合劑(c)或放射性核素(r)中的一種或多種。在一些實施例中，小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177中任一個的氨基酸序列或根據seq?id?no:161-176和/或表1c中任一個的氨基酸序列。

53、在一些實施例中，本披露提供了包含小蛋白(m)的藥物組合物，其中所述小蛋白選擇性結合靶標。

54、在一些實施例中，本披露提供了包含一個或多個小蛋白(m)x的藥物組合物，其中所述小蛋白選擇性結合連接素-4，并且x是1、2、3或4。

55、在一些實施例中，組合物展示出在腫瘤中的粘附。在一些實施例中，組合物展示出通過腎、肝、骨髓或脾。

56、在一些實施例中，本披露提供了藥物組合物，其包含小蛋白(m)x、任選的接頭(l)、以及螯合劑(c)和放射性核素(r)中的一者或兩者，其中x是1、2、3或4。在一些實施例中，當c存在時，c共價附接至m。在一些實施例中，螯合效率>90％。在一些實施例中，藥物組合物進一步包含放射性核素r。在一些實施例中，r當存在時是α發射體。在一些實施例中，r當存在時是ac-225、in-111、ga-68、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。在一些實施例中，m特異性結合靶標。在一些實施例中，靶標是連接素-4。在一些實施例中，連接素-4在細胞上表達。在一些實施例中，細胞是人細胞。在一些實施例中，人細胞是腫瘤細胞。在一些實施例中，腫瘤細胞是實體瘤細胞。在一些實施例中，所述小蛋白包含以下或由以下組成：半胱氨酸密集肽、打結素肽、結合物、親和體、經工程改造的庫尼茨(kunitz)結構域、單抗體、抗運載蛋白(anticalin)、設計的錨蛋白重復結構域(darpin)或avimer。在一些實施例中，小蛋白包含一個或多個二硫鍵。在一些實施例中，小蛋白的特征在于它在體內或基于細胞的測定中對靶標具有nm或亞nm結合親和力。在一些實施例中，小蛋白對表達人連接素-4的細胞系上的連接素-4具有1pm至100nm的結合親和力。在一些實施例中，小蛋白具有的結合親和力約是針對表2中化合物所披露的結合親和力。在一些實施例中，小蛋白具有不超過約100個氨基酸或更少、90個氨基酸、85個氨基酸、80個氨基酸、75個氨基酸、70個氨基酸、65個氨基酸、60個氨基酸、55個氨基酸、50個氨基酸、45個氨基酸、40個氨基酸、35個氨基酸、30個氨基酸、25個氨基酸、20個氨基酸、15個氨基酸、10個氨基酸或5個氨基酸的氨基酸序列。

57、在一些實施例中，向有需要的受試者施用藥物組合物不引發免疫應答或者其中引發的免疫應答對于受試者是可耐受的。在一些實施例中，組合物包含高腫瘤組織穿透。在一些實施例中，組合物展示出在腫瘤中的粘附。在一些實施例中，組合物不被腎或肝攝取和/或保留。在一些實施例中，組合物被內化在表達人連接素-4的細胞中。在一些實施例中，小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177中任一個的氨基酸序列。在一些實施例中，小蛋白包含根據seq?id?no:161-176中任一個的氨基酸序列。在一些實施例中，小蛋白的氨基酸序列進一步包含表1c中所示的一個或多個取代。

58、在一些實施例中，組合物包含小蛋白-藥物綴合物，其包含小蛋白和至少一個藥物部分。在一些實施例中，藥物組合物包含小蛋白-藥物綴合物，其包含小蛋白和至少一個藥物部分。在某些實施例中，藥物部分包括但不限于v-atp酶抑制劑、促凋亡劑、bcl2抑制劑、mcl1抑制劑、hsp90抑制劑、iap抑制劑、mtor抑制劑、微管穩定劑、微管去穩定劑、奧瑞他汀、多拉司他汀、美登木素生物堿(maytansinoid)、metap(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白crml核輸出抑制劑、dppiv抑制劑、蛋白酶體抑制劑、線粒體中磷?；D移反應的抑制劑、蛋白合成抑制劑、激酶抑制劑、cdk2抑制劑、cdk9抑制劑、驅動蛋白抑制劑、hdac抑制劑、dna損傷劑、dna烷化劑、dna嵌入劑、dna小溝結合劑、拓撲異構酶抑制劑、免疫毒素和/或dhfr抑制劑或其功能衍生物、變體或部分。

59、在其他實施例中，藥物部分包括但不限于烷化劑，例如thiotepa和環磷酰胺(cytoxantm)；烷基磺酸鹽，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類(aziridines)，如苯并多巴(benzodopa)、卡巴醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亞胺和甲基蜜胺類(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亞乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰類(acetogenins)(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹堿(包括合成類似物拓撲替康)；苔蘚蟲素；卡利他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)及其衍生物；念珠藻素類(cryptophycines)(具體是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀、奧瑞他汀(包括類似物單甲基-奧瑞他汀e和單甲基-奧瑞他汀f(參見，例如，美國公開申請號2005-0238649，公開于2005年10月27日，以其全文并入本文)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成類似物，kw-2189和cbi-tmi)；五加素(eleutherobin)；水鬼蕉堿(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素(spongistatin)；氮芥類，如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、異環磷酰胺、氮芥、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine?oxide?hydrochloride)、美法侖、新恩比興(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)；曲磷胺(trofosf?amide)、烏拉莫司?。粊喯趸孱?nitrosureas)，如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、環己亞硝脲、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1i和卡奇霉素phill(參見，例如，agnew,chem.intl.ed.engl.[應用化學英文國際版],33:183-186；達內霉素(dynemicin)，包含達內霉素a；雙膦酸鹽類，例如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素發色團(neocarzinostatin?chromophore)及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、氮雜絲氨酸、博來霉素(bleomycin)、放線菌素c(cactinomycin)、卡拉霉素(carabicin)、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放線菌素d(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(adriamycintm)(包括嗎啉基-多柔比星、氰嗎啉基-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星及脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubucin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)(例如絲裂霉素c)、霉酚酸(mycophenolic?acid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycine)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱，6-巰嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如環胞苷(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖孢苷、二脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，例如卡普睪酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、環硫雄醇、美雄烷、睪內酯；抗腎上腺類，如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例如亞葉酸；醋葡醛內酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地佛法明(defofamine)；地美可辛(democolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋銨(elliptiniumacetate)；埃博霉素；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物堿，如美登素和安絲菌素(ansamitocins)；米托瓜腙、米托蒽醌；莫哌達醇(mopidamol)；硝基胺(nitracrine)；噴司他?。槐絹砻捞?phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic?acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼；丙亞胺(razoxane)；根霉素；西佐喃；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic?acid)；三亞胺醌；-三氯三乙胺；單端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、維拉庫林(verracurin)a、桿孢菌素(roridin)a和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitabronitol)；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；環磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如，紫杉醇(taxoltm，百時美施貴寶公司腫瘤部(bristol-myers?squibb?oncology),普林斯頓,新澤西州)和多西他賽(納普朗克樂安公司(rhone-poulenc?rorer),安東尼,法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemzartm)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物，如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(vp-16)；異環磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱(navelbinetm)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷；依達曲沙(edatrexate)；道諾霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鈉(ibandronate)；cpt-11；二氟甲基鳥氨酸(dmfo)；類視黃醇，如視黃酸；卡培他濱；以及任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

60、在一些實施例中，藥物部分是或包含奧瑞他汀。在一些這樣的實施例中，奧瑞他汀包括類似物，例如單甲基-奧瑞他汀e和單甲基-奧瑞他汀f(參見例如，美國公開申請號2005-0238649，公開于2005年10月27日，以其全文并入本文。

61、在一些實施例中，藥物部分包括但不限于用于調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑(serm)，包括例如他莫昔芬(包括nolvadextm)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、酮昔芬、ly117018、奧那司酮和托瑞米芬(farestontm)；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑(其調節腎上腺中雌激素產生)，例如比如4(5)-咪唑、氨基谷氨酰胺、乙酸甲地孕酮(megacetm)、依西美坦、甲霉胺(formestane)、法倔唑、伏氯唑(rivisortm)、來曲唑(femaratm)和阿那曲唑(arimidextm)；和抗雄激素類，例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。

62、在一些實施例中，藥物部分是或包含拓撲異構酶抑制劑，包括但不限于伊立替康、拓撲替康、喜樹堿、依托泊苷、磷酸依托泊苷、多柔比星、表柔比星、吲哚并咔唑及衍生物、菲啶及衍生物、茚并異喹啉及衍生物、安吖啶、替尼泊苷、道諾霉素、米托蒽醌、伊達比星、因多替康(indotecan)、茚替康、片螺素d、sn-38、依喜替康、勒托替康、二氟替康、吉馬替康、勒托替康、貝洛替康、依多卡林(edotecarin)、羅塞塔辛、科西特康、依替立替康聚乙二醇化物(etirinotecan?pegol)、hocpt、西拉替康(silatecan)、艾莫替康(elmotecan)、拓撲異構酶抑制劑rfs2000；或其功能衍生物或部分。

63、在一些實施例中，藥物部分是或包含免疫毒素或其功能衍生物、變體或部分。在一些實施例中，免疫毒素是以下或包含以下：erb38、scfv(frp5)-eta、ssip(ssi(dsfv)-pe38、lmb-i、lmb-7、lmb-9、sgn-10、ovb3-pe、tp40、地尼白介素(denileukin?diftitox)、莫賽妥莫單抗(moxetumomab?pasudotox)、lmb-2、uchti、d2219arl、ssip、moc31pe、莫妥組單抗(oportuzumab?monatox)、humi95-多花白樹毒蛋白、rg7787、vb8-845?hsgz、d2c7-(scdsfv)-pe38kdei或其功能衍生物、變體或部分。

64、在一些實施例中，藥物組合物包含一種或多種抗氧化劑分子，其中抗氧化劑分子中和自由基。在一些實施例中，藥物組合物包含穩定劑。在進一步的實施例中，穩定劑包含龍膽酸或其鹽、抗壞血酸或其鹽、甲硫氨酸、n-乙酰半胱氨酸、組氨酸、褪黑素、乙醇、se-甲硫氨酸或其組合。在一些實施例中，藥物組合物的特征在于表現出對肽酶、蛋白酶或熱的改善的抗性。

65、在一些實施例中，一種產生由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r中的一個或多個的式表示的組合物的方法，其中m包含小蛋白(m)，l包含接頭(l)，c包含螯合劑(c)，r包含放射性核素(r)，并且x是1、2、3或4，所述方法包含合成小蛋白(m)和/或接頭(l)，并且任選地使螯合劑(c)和/或放射性核素(r)反應，并且綴合小蛋白(m)中的一個或多個至接頭(l)，綴合小蛋白(m)中的一個或多個至螯合劑(c)，綴合小蛋白(m)中的一個或多個至放射性核素(r)，綴合小蛋白(m)中的一個或多個至接頭(l)至螯合劑(c)，綴合小蛋白(m)中的一個或多個至接頭(l)至螯合劑(c)和放射性核素(r)，綴合小蛋白(m)中的一個或多個至螯合劑(c)至放射性核素(r)，或者綴合小蛋白(m)中的一個或多個至接頭(l)至放射性核素(r)。

66、在一些實施例中，所述方法涉及在孵育期間使螯合劑(c)和放射性核素(r)在約10℃至65℃之間的溫度下反應。在一些實施例中，螯合劑(c)和放射性核素(r)的反應在約5分鐘至約30分鐘的孵育期內進行。在進一步實施例中，螯合劑(c)和放射性核素(r)的反應在約5.0至7.4范圍內的ph下進行。在一些實施例中，螯合劑(c)和放射性核素(r)的反應在基本上不含醇的水性溶液中進行。

67、在一些實施例中，將放射性核素遞送至患者體內選定位置的方法涉及施用由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r中的一個或多個的式表示的組合物，其中m包含小蛋白(m)，l包含接頭(l)、c包含螯合劑(c)，r包含放射性核素(r)，并且x是1、2、3或4。在一些實施例中，放射性核素選自ac-225、in-111、ga-68、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。在一些實施例中，所述方法進一步包括執行成像程序以評價放射性核素在體內的定位，其中所述成像程序任選地包括正電子發射斷層掃描(pet)成像或單光子發射計算機斷層掃描(spect)成像。在進一步實施例中，成像程序允許選擇患者。在某些實施例中，成像程序允許監測患者。在一些實施例中，成像程序允許確定用于治療需要包含一種或多種小蛋白的藥物組合物的患者的適當劑量。

68、在一些實施例中，本披露提供了包含小蛋白(m)、任選的接頭(l)、和/或螯合劑(c)和放射性核素(r)中的一者或兩者的組合物，其由選自(m)x-l-c-r、(m)x-l-c、(m)x-c-r、(m)x-l-r、(m)x-c、(m)x-l和(m)x-r(其中x是1、2、3或4)中的一個或多個的式表示。在一些實施例中，m包含選自以下中任一個的序列或由選自以下中任一個的序列組成：seq?id?no:1-158或177或其功能變體或部分或seq?id?no:161-176和/或根據表1b和/或1c或其功能變體或部分。在一些實施例中，l當存在時包含以下或由以下組成：peg4、peg、peg2、peg6、peg8、peg12、peg24的聚乙二醇(peg)接頭、酯接頭、酰胺接頭、馬來酰亞胺接頭、纈氨酸-瓜氨酸接頭、腙接頭、n-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)接頭、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(smcc)接頭、基于乙烯基砜的接頭、丙酸接頭、癸烯酸接頭、或(gly)n-(γglu)n-或(peg)n(其中n是1至10)、(gly)1-10、或其經由共價鍵的任何片段或組合。在一些實施例中，c當存在時包含以下或由以下組成：

69、i)dota

70、

71、ii)冠

72、

73、iii)nopo，或

74、

75、iv)大環配體

76、

77、在一些實施例中，r當存在時包含以下或由以下組成：ac-225、in-111、ga-68、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。

78、在一些實施例中，本披露提供了治療有需要的受試者的方法，所述方法包括施用包含小蛋白(m)、任選的接頭(l)、以及螯合劑(c)和放射性核素(r)中的一者或兩者的組合物。

79、在一些實施例中，l包含以下或由以下組成：聚乙二醇(peg)接頭、酯接頭、酰胺接頭、馬來酰亞胺接頭、纈氨酸-瓜氨酸接頭、腙接頭、n-琥珀酰亞胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(spdb)接頭、琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(smcc)接頭、基于乙烯基砜的接頭、丙酸接頭、癸烯酸接頭、或其任何片段或組合。在一些實施例中，c包含以下或由以下組成：

80、i)dota

81、

82、ii)冠

83、

84、iii)nopo，或

85、

86、iv)大環配體

87、

88、在一些實施例中，r包含以下或由以下組成：ac-225、in-111、ga-68、pb-212、lu-177、cu-67、cu-64、la-132、la-135或ce-134。在一些實施例中，m包含以下或由以下組成：半胱氨酸密集多肽、打結素、結合物、親和體、經工程改造的庫尼茨(kunitz)結構域、單抗體、抗運載蛋白(anticalin)、設計的錨蛋白重復結構域(darpin)或avimer。在一些實施例中，m的特征在于它包含(i)不超過1,000個氨基酸、900個氨基酸、800個氨基酸、700個氨基酸、600個氨基酸、500個氨基酸、400個氨基酸、300個氨基酸、200個氨基酸或100個氨基酸。在一些優選實施例中，m的特征在于它包含(i)不超過100個氨基酸和/或12kda；(ii)至少兩個二級結構元件；(iii)隔離的疏水核心；和/或展示協同折疊。在一些實施例中，組合物包含至少一個另外的加組分。在一些實施例中，組合物可以穿透腫瘤組織。在一些實施例中，小蛋白包含不超過約100個氨基酸或更少、90個氨基酸、85個氨基酸、80個氨基酸、75個氨基酸、70個氨基酸、65個氨基酸、60個氨基酸、55個氨基酸、50個氨基酸、45個氨基酸、40個氨基酸、35個氨基酸、30個氨基酸、25個氨基酸、20個氨基酸、15個氨基酸、10個氨基酸或5個氨基酸。在一些實施例中，小蛋白包含至少一個二硫橋。在一些實施例中，小蛋白特異性結合靶標。在一些實施例中，組合物在體外測定中表現出對靶標的mm或nm結合親和力。

89、在一些實施例中，組合物以100pm至100nm的親和力結合靶標，如通過體外結合測定所測量的。在一些實施例中，組合物以大約針對表1c的任何化合物所示的親和力結合連接素-4。

90、在一些實施例中，組合物的特征在于相對于包含結合相同靶標的全尺寸蛋白的組合物，它具有高組織穿透特性。在一些實施例中，與靶標結合的小蛋白調節生物功能。

91、在一些實施例中，向有需要的受試者施用組合物不引發免疫應答或者其中引發的免疫應答對于受試者是可耐受的。在一些實施例中，可耐受的免疫應答包括系統性免疫應答或局部免疫應答。

92、在一些實施例中，受試者被診斷為患有癌癥。在一些實施例中，來自受試者的癌細胞表達連接素-4或其部分。在一些實施例中，癌細胞中靶標的表達高于非癌細胞中的表達。

93、在一些實施例中，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤、胰腺癌、周圍神經瘤、膠質母細胞瘤、腎上腺皮質癌、aids相關淋巴瘤、肛門癌、膀胱癌、腦膜瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、宮頸癌、慢性骨髓增殖性障礙、結腸癌、子宮內膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文氏肉瘤、顱外生殖細胞瘤、肝外膽管癌、膽囊癌、胃癌、胃腸道類癌瘤、妊娠滋養細胞瘤、毛細胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、下咽癌、胰島細胞癌、卡波西肉瘤、喉癌、白血病、唇癌、口腔癌、肝癌、男性乳腺癌、惡性間皮瘤、髓母細胞瘤、梅克爾細胞癌、轉移性頸部鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤和其他漿細胞腫瘤、蕈樣肉芽腫和塞扎里綜合征、骨髓增生異常綜合征、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸癌、皮膚癌、口咽癌、骨癌(包括骨肉瘤和骨惡性纖維組織細胞瘤)、鼻竇癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤、松果體母細胞瘤、睪丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管的移行細胞癌、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌以及腎母細胞瘤和其他兒童腎腫瘤。

94、在一些實施例中，組合物靜脈內或皮下施用。在一些實施例中，在施用組合物之后癌癥被治療。

95、在一些實施例中，本披露提供了靶向表達連接素-4的癌細胞群的方法，所述方法包括：(i)確定癌細胞群中靶標的表達水平；(ii)向有需要的受試者施用包含本文提供的多肽的組合物、如本文提供的組合物或如本文提供的藥物組合物，其中所述組合物包含至少一個特異性結合連接素-4的組分，其中所述組合物靶向表達連接素-4的細胞并被內化到表達連接素-4的細胞中；(iii)其中與施用之前相比，在施用之后患者被治療；并且治療不會損傷不表達連接素-4的細胞。在一些實施例中，多肽包含小蛋白(m)或由其組成，所述小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177或161-176和/或表1c中任一個的氨基酸序列。

96、在一些實施例中，本披露提供了小蛋白綴合物，其包含：(i)與連接素-4特異性結合的小蛋白(m)；(ii)通過任選的接頭(l)與(m)綴合的螯合劑(c)，其中(c)包含dota，并且(l)當存在時包含peg；以及(iii)與(c)螯合的放射性核素(r)，其中(r)是錒-225。

97、在一些實施例中，本披露提供了小蛋白綴合物，其包含：(i)與連接素-4特異性結合的小蛋白(m)；(ii)通過任選的接頭(l)與(m)綴合的螯合劑(c)，其中(c)包含dota，并且(l)當存在時包含peg；以及(iii)與(c)螯合的放射性核素(r)，其中(r)是銦-111。

98、在一些實施例中，本披露提供了小蛋白綴合物，其包含：(i)與連接素-4特異性結合的小蛋白(m)；(ii)通過任選的接頭(l)與(m)綴合的螯合劑(c)，其中(c)包含dota，并且(l)當存在時包含peg；以及(iii)與(c)螯合的放射性核素(r)，其中(r)是鎵-68。

99、在一些實施例中，本披露提供了小蛋白綴合物，其包含：(i)與連接素-4特異性結合的小蛋白(m)；(ii)通過任選的接頭(l)與(m)綴合的螯合劑(c)，其中(c)包含dota，并且(l)當存在時包含peg；以及(iii)與(c)螯合的放射性核素(r)，其中(r)是銅-64。

100、在一些實施例中，如本文提供的小蛋白綴合物包含小蛋白(m)，所述小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177或161-176和/或表1c中任一個的氨基酸序列。

101、在一些實施例中，靶標是細胞粘附受體、細胞因子受體、趨化因子受體、生長因子受體、免疫細胞受體或腫瘤相關的胞外基質多肽。在一些這樣的實施例中，靶標包含以下或由以下組成：連接素-4或其部分。在一些實施例中，靶標包含與seq?id?no:159或seq?idno:160中所示的氨基酸序列至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。

102、在一些實施例中，小蛋白特異性結合靶標。在一些實施例中，小蛋白結合包含以下或由以下組成的蛋白：與seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個所示和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。

103、在一些實施例中，所述小蛋白包含與seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個所示和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

104、在一些實施例中，靶標是連接素-4。在一些實施例中，小蛋白選擇性結合連接素-4或其部分。在一些實施例中，小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分。在一些實施例中，氨基酸序列中的至少2個氨基酸結合至靶標上的位置。在一些實施例中，小蛋白在體外測定中表現出對靶標的μm或nm結合親和力。在一些實施例中，小蛋白具有與seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個所示和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分至少98％同一的氨基酸序列。在一些實施例中，小蛋白具有與seq?id?no:1-1-158或177或161-176中任一個所示和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分至少99％同一的氨基酸序列。在一些實施例中，組合物由seq?id?no:1-158或177或161-176中和/或根據表1b和/或1c的任一個或其任何功能變體或部分組成。在一些實施例中，小蛋白以約1pm至約500nm的親和力結合靶標。在一些實施例中，小蛋白以約1pm至約500nm的親和力結合靶標，例如，如通過體外結合測定所測量的。在一些實施例中，親和力是約100pm至約10nm。在一些實施例中，小蛋白的特征在于相對于對應相同靶標的全尺寸蛋白，它具有較高的組織穿透特性。在一些實施例中，小蛋白在環境條件下是穩定的。在一些實施例中，小蛋白在80攝氏度下穩定。

105、在一些實施例中，小蛋白選擇性結合連接素-4或其部分。在一些實施例中，小蛋白包含選自seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分。在一些實施例中，氨基酸序列中的至少2個氨基酸結合至靶標上的位置。在一些實施例中，小蛋白以約1pm至約500nm的親和力結合靶標，例如，如通過體外結合測定所測量的。在一些實施例中，小蛋白的特征在于相對于對應相同靶標的全尺寸蛋白，它具有較高的組織穿透特性。

106、在一些實施例中，本披露提供了編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含以下或由以下組成：seq?id?no:1-158或177或161-176中任一個的氨基酸序列或其功能片段或部分。在一些實施例中，序列是密碼子優化的。

107、在一些實施例中，本披露提供了包含一個或多個多核苷酸的一個或多個載體，其中所述一個或多個多核苷酸編碼一個或多個多肽，所述一個或多個多肽包含氨基酸序列或由所述氨基酸序列組成，所述氨基酸序列包含以下或由以下組成：seq?id?no:1-158或177或161-176中和/或根據表1b和/或1c的任一個或其任何功能變體或部分。

108、在一些實施例中，本披露提供了分離的多核苷酸，其包含編碼seq?id?no:1-158或177或161-176中和/或根據表1b和/或1c的一個或多個或其任何功能變體或部分的一個或多個核酸序列。在一些這樣的實施例中，此類核酸編碼與seq?id?no:1-158或177或161-176和/或根據表1b和/或1c的氨基酸序列或其任何功能變體或部分包含至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的多肽。

109、在一些實施例中，本披露提供了包含編碼多肽的載體的宿主細胞，所述多肽包含或由以下組成：seq?id?no:1-158或177或161-176中和/或根據表1b和/或1c的任一個或其任何功能變體或部分。

110、在一些實施例中，本披露提供了一種分離的多肽，其具有包含以下或由以下組成的氨基酸序列：選自根據表1b和1c的seq?id?no:161-176的一個或多個氨基酸序列；或與根據表1b和1c的seq?id?no:161-176具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的一個或多個氨基酸序列。在一些實施例中，多肽包含不超過100個氨基酸。在一些實施例中，多肽特異性結合連接素-4或其部分。

111、在一些實施例中，本披露提供了分離的多核苷酸，其包含編碼選自seq?id?no:161-176和/或根據表1b和1c的多肽的一個或多個核酸序列；或編碼與seq?id?no:161-176和/或根據表1b和/或1c的多肽具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的多肽的核酸序列。在一些實施例中，多肽不以大于10nm的親和力結合非靶標(例如非靶標蛋白)。在一些實施例中，非靶標不包括連接素-4或其功能變體或部分。