本公開涉及基因工程領域，具體地，涉及一種啟動子元件、一種rna編碼元件、一種esgrna、一種sgrna雙向增強表達序列、一種能夠在植物中進行高效基因編輯的載體及一種對植物進行基因編輯的方法。

背景技術：

1、crispr-cas9基因編輯技術是一種能精確高效地進行基因編輯域修飾的方法，對農作物的遺傳改良與功能基因研究具有重要的應用價值。通過人工設計的單一引導rna（single?guide?rna，sgrna），該技術能識別目標基因，并引導cas9蛋白酶進行目標基因的切割，從而實現基因插入或敲除，對植物的種質創新及高產新品種的研發有關鍵的作用。

2、然而，傳統的強啟動子如2x35s雖然常用于植物基因編輯，但其驅動效率相對有限，導致編輯效率不夠高，尤其是在復雜基因組或高等植物中。外源grna序列可能觸發植物的免疫反應，導致rna降解，從而進一步降低編輯效率和穩定性。由此可知，目前的crispr-cas9基因編輯技術存在以下2個主要的問題：（1）目前的啟動子（如35s強啟動子）轉錄活性低，基因編輯效率也相應較低；這意味著在基因編輯過程中，需要大量的篩選工作來找出基因編輯陽性的植株，使得全過程變得很費力。（2）由于缺乏同時提高cas9基因和sgrna表達量的方法，提高基因編輯效率的努力受到了限制。因此，尋找具有更高轉錄活性的啟動子，以及開發能同時提高cas9基因和sgrna表達量的方法，無疑對基因編輯技術的改進至關重要。

3、綜上可知，現有的crispr-cas9基因編輯技術在多倍體遺傳改良和功能基因研究中，仍面臨純化或雙等位編輯效率低和難以同時提高cas9基因和sgrna表達量的問題。

技術實現思路

1、本公開的目的是提供一種啟動子元件，該啟動元件及載體能夠提高植物的基因編輯效率和靶向特異性。本公開還提供了一種sgrna雙向增強表達序列，進一步提高了植物的基因編輯效率和靶向特異性。

2、為了實現上述目的，本公開第一方面提供一種啟動子元件，所述啟動子元件的核苷酸序列為seq?id?no.1所示的核苷酸序列的全長或seq?id?no.1所示的核苷酸序列的片段；所述seq?id?no.1所示的核苷酸序列的片段包含seq?id?no.1所示的核苷酸序列的第987-1709位；優選地，所述seq?id?no.1所示的核苷酸序列的片段包含seq?id?no.1所示的核苷酸序列的第653-1709位。

3、本公開第二方面提供一種rna編碼元件，所述rna編碼元件的核苷酸序列為seq?idno.2所示的核苷酸序列。

4、本公開第三方面提供一種sgrna雙向增強表達序列，所述sgrna雙向增強表達序列包括第二方面所述的rna編碼元件和esgrna；

5、所述sgrna雙向增強表達序列為seq?id?no.4所示的核苷酸序列。

6、可選地，所述esgrna為在原始sgrna上增加、減少或替換部分核苷酸后得到的序列；所述esgrna的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7、本公開第四方面提供一種能夠在植物中進行高效基因編輯的載體，所述載體插入有第一方面所述的啟動子元件，優選地，還插入有第二方面所述的rna編碼元件。

8、可選地，所述載體中在第一方面所述的啟動子元件的上游還插入有2x35sp啟動子、sgrna插入區、eu終止子；所述sgrna插入區插入有第三方面所述的sgrna雙向增強表達序列或者esgrna。

9、可選地，所述載體中在第一方面所述的啟動子元件的下游還插入有spcas9蛋白表達元件、ubp終止子和潮霉素篩選標記。

10、本公開第五方面提供一種對植物進行基因編輯的方法，該方法包括如下步驟：

11、s1、在第四方面所述的載體的sgrna插入區中插入靶向待編輯基因的grna編碼序列，得到基因編輯載體；

12、s2、用所述基因編輯載體轉化農桿菌，得到轉化體；

13、s3、將所述轉化體侵染植物培養體，得到侵染后的植物培養體；

14、s4、將所述侵染后的植物培養體在含有潮霉素的培養基中進行培養，得到基因編輯后的植物。

15、可選地，所述靶向待編輯基因的grna的核苷酸序列為seq?id?no.5。

16、可選地，所述植物選自煙草、番茄、大豆、棉花、辣椒、油菜、茄子、白菜、生菜、甘藍、馬鈴薯、花生、黃瓜、西瓜、向日葵、草莓、蘿卜、柑橘、苜蓿、楊樹、擬南芥、芝麻、藜麥、田菁、葡萄、蘋果、梨、獼猴桃、菊花、蒲公英、蝴蝶蘭和冬凌草，以及水稻、小麥、玉米、高粱、菰米和小米、甘蔗、竹子、洋蔥、韭菜、生姜、香蕉和百合中的至少一種；

17、優選為煙草。

18、通過上述技術方案，本公開的啟動子元件能夠提高植物的基因編輯效率，提升純合編輯效率到3倍。本公開的sgrna雙向增強表達序列與啟動子元件制備的編輯載體，進一步提高了植物的基因編輯效率，提升純合編輯效率到5.3倍。含有本公開啟動子元件和/或sgrna雙向增強表達序列的編輯載體，可顯著提升sgrna表達水平及基因編輯純合株系的獲得，為實現植物全基因組編輯，基因功能解析提供支撐。

19、本公開的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

技術特征：

1.一種啟動子元件，其特征在于，所述啟動子元件的核苷酸序列為seq?id?no.1所示的核苷酸序列的全長或seq?id?no.1所示的核苷酸序列的片段；所述seq?id?no.1所示的核苷酸序列的片段包含seq?id?no.1所示的核苷酸序列的第987-1709位；優選地，所述seq?idno.1所示的核苷酸序列的片段包含seq?id?no.1所示的核苷酸序列的第653-1709位。

2.一種rna編碼元件，其特征在于，所述rna編碼元件的核苷酸序列為seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

3.一種sgrna雙向增強表達序列，其特征在于，所述sgrna雙向增強表達序列包括權利要求2所述的rna編碼元件和esgrna；

4.根據權利要求3所述的sgrna雙向增強表達序列，其中，所述esgrna為在原始sgrna上增加、減少或替換部分核苷酸后得到的序列；

5.一種能夠在植物中進行高效基因編輯的載體，其特征在于，所述載體插入有權利要求1所述的啟動子元件，優選地，還插入有權利要求2所述的rna編碼元件。

6.根據權利要求5所述的載體，其中，所述載體中在權利要求1所述的啟動子元件的上游還插入有2x35sp啟動子、sgrna插入區、eu終止子；

7.根據權利要求5所述的載體，其中，所述載體中在權利要求1所述的啟動子元件的下游還插入有spcas9蛋白表達元件、ubp終止子和潮霉素篩選標記。

8.一種對植物進行基因編輯的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：

9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述靶向待編輯基因的grna的核苷酸序列為seqid?no.5。

10.根據權利要求8所述的方法，其中，所述植物選自煙草、番茄、大豆、棉花、辣椒、油菜、茄子、白菜、生菜、甘藍、馬鈴薯、花生、黃瓜、西瓜、向日葵、草莓、蘿卜、柑橘、苜蓿、楊樹、擬南芥、芝麻、藜麥、田菁、葡萄、蘋果、梨、獼猴桃、菊花、蒲公英、蝴蝶蘭和冬凌草，以及水稻、小麥、玉米、高粱、菰米和小米、甘蔗、竹子、洋蔥、韭菜、生姜、香蕉和百合中的至少一種；

技術總結
本公開涉及一種啟動子元件及對植物進行基因編輯的方法。具體地，涉及一種啟動子元件、一種RNA編碼元件、一種esgRNA、一種sgRNA雙向增強表達序列、一種能夠在植物中進行高效基因編輯的載體及一種對植物進行基因編輯的方法。該啟動元件及載體能夠提高植物的基因編輯效率和靶向特異性，sgRNA雙向增強表達序列能夠進一步提高了植物的基因編輯效率和靶向特異性。

技術研發人員：代常波,呂婧,晁江濤,丁安明,李冰潔,陳琛,王風嬌,薛凱麗,孫玉合
受保護的技術使用者：中國農業科學院煙草研究所（中國煙草總公司青州煙草研究所）
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24