本發明屬于生物基因工程，具體涉及一種重組嘌呤核苷脫氨酶及其應用。

背景技術：

1、該類嘌呤核苷脫氨酶為一種包含鋅離子的酶類，隸屬于胞苷脫氨酶家族，廣泛存在于植物與藻類參與機體嘌呤代謝，以及調控種子萌發，但在哺乳動物與微生物中缺乏這種酶。此酶對2’-脫氧鳥嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷及2’-脫氧甲基鳥苷具有較好催化活性，能促進氨基與羰基的轉化。2013年，dahncke?et?al[1]首次在模式生物擬南芥中識別并克隆該酶類。2018年schroeder?et?al[2]發現該酶突變可延遲種子發芽。2021年xie?et?al[3]采用高分辨率方法解析了擬南芥中該酶的自由態和配體結合態結構。與鳥嘌呤脫氨酶不同，此酶采用單質子穿梭機制進行催化，底物和酶都發生結構重排。酶的最后一段回折并封閉活性位點，而底物在反應過程中旋轉，這些都是脫氨基作用所必需的。

2、嘌呤核苷/脫氧核苷，是以嘌呤核為堿基部分的核苷的總稱，包含腺嘌呤核苷(腺苷)、鳥嘌呤核苷(鳥苷)和黃嘌呤核苷(黃苷)、次黃嘌呤核苷(肌苷)及對應嘌呤脫氧核苷。它們的化學結構由核糖或脫氧核糖與嘌呤堿基組成，可以作為細胞內的能量源，參與核酸和蛋白質的合成，還具有調節細胞信號傳導、抗炎、抗氧化和免疫調節、增鮮等作用。因此，在藥物研究、臨床及食品應用中具有重要的地位。黃嘌呤核苷作為嘌呤核苷家族成員，研究揭示對乳腺干細胞、骨髓移植細胞增殖及腫瘤治療中具有重要作用，同時作為黃嘌呤、咖啡因與可可堿的上游分子，具有較大應用空間。當前，此產品制備主要依托重氮化/水解或氨基還原等化學反應實現。然而，化學合成過程存在選擇性差、雜質多、收率偏低、環保處理壓力大或制備工藝危險等不利因素，導致產品價格高昂，極大限制了產品的應用拓展，亟需新的生產工藝解決該現狀。

3、參考文獻：

4、[1]k.dahncke?and?c.p.witte,plant?cell,2013,25,4101-4109.

5、[2]r.y.schroeder,a.zhu,h.eubel,k.dahncke?and?c.p.witte,new?phytol.,2018,217,233-244

6、[3]qian?jia,hui?zeng,huanxi?li,nan?xiao,jing?tang,shangfang?gao,jinbing?zhang?and?wei?xie，chem.commun，2021，57,9748

技術實現思路

1、為了解決化學合成黃嘌呤核苷的方法中過程復雜、收率低、不安全因素多等問題，本發明提供一種重組嘌呤核苷脫氨酶及其應用。

2、為達到以上技術目的，本申請采用的技術方案如下：

3、第一方面，本發明提供一種重組嘌呤核苷脫氨酶，所述重組嘌呤核苷脫氨酶是將seq?id?no.1所示的基因序列與pet載體進行連接并增加his標簽獲得，所述重組嘌呤核苷脫氨酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

4、第二方面，本發明提供嘌呤核苷脫氨酶基因重組載體，其特征在于，是將seq?idno.1所示的基因序列與pet載體進行連接，所述重組載體具有如seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

5、優選地，所述pet載體選自pet-24a，pet-22b，pet-28a，pet-30a或pet-32a。

6、第三方面，本發明提供一種微生物，其包含第二方面所述的嘌呤核苷脫氨基因重組載體。

7、優選地，所述微生物為大腸桿菌，畢赤酵母菌，或者枯草芽孢桿菌。

8、進一步優選地，所述微生物是大腸桿菌bl21(de3)。

9、第四方面，本發明提供第一方面所述的重組嘌呤核苷脫氨酶或者第三方面所述的微生物在生產黃嘌呤核苷中的用途。

10、第五方面，本發明提供一種生產黃嘌呤核苷的方法，包括如下步驟：以鳥嘌呤核苷為反應底物，加入第一方面所述的重組嘌呤核苷脫氨酶或者第三方面所述的微生物進行催化脫氨反應，即獲得黃嘌呤核苷。

11、優選地，所述催化脫氨反應的體系中還添加氯化鈉溶液和hepes緩沖液。

12、進一步優選地，所述氯化鈉溶液濃度為1～2m，所述hepes緩沖液ph為7.0～7.5。

13、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

14、本發明通過構建表達一種重組的嘌呤核苷脫氨酶的工程菌，以及嘗試以鳥嘌呤核苷作為底物，該底物經工程酶催化，進而獲得黃嘌呤核苷。本發明的工藝方法與化學合成相比，具有成本低、轉化率高、工藝簡單、安全且環保綠色的優勢，可以大幅度擴展黃嘌呤核苷的應用空間。

技術特征：

1.一種重組嘌呤核苷脫氨酶，其特征在于，所述重組嘌呤核苷脫氨酶是將seq?id?no.1所示的基因序列與pet載體進行連接并增加his標簽獲得，所述重組嘌呤核苷脫氨酶的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2.嘌呤核苷脫氨酶基因重組載體，其特征在于，是將seq?id?no.1所示的基因序列與pet載體進行連接，所述重組載體具有如seq?id?no.3所示的核苷酸序列。

3.根據權利要求2所述的嘌呤核苷脫氨酶基因重組載體，其特征在于，所述pet載體選自pet-24a，pet-22b，pet-28a，pet-30a或pet-32a。

4.一種微生物，其特征在于，其包含權利要求2或3所述的嘌呤核苷脫氨基因重組載體。

5.根據權利要求4所述的微生物，其特征在于，所述微生物為大腸桿菌，畢赤酵母菌，或者枯草芽孢桿菌。

6.根據權利要求4或5所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大腸桿菌bl21(de3)。

7.權利要求1所述的重組嘌呤核苷脫氨酶或者權利要求4～6任一項所述的微生物在生產黃嘌呤核苷中的用途。

8.一種生產黃嘌呤核苷的方法，其特征在于，包括如下步驟：以鳥嘌呤核苷為反應底物，加入權利要求1所述的重組嘌呤核苷脫氨酶或者權利要求4～6任一項所述的微生物進行催化脫氨反應，即獲得黃嘌呤核苷。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化脫氨反應的體系中還添加氯化鈉溶液和hepes緩沖液。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述氯化鈉溶液濃度為1～2m，所述hepes緩沖液ph為7.0～7.5。

技術總結
本發明提供一種重組嘌呤核苷脫氨酶及其應用，該重組嘌呤核苷脫氨酶是將SEQ?ID?NO.1所示的基因序列與PET載體進行連接并增加HIS標簽獲得，該重組嘌呤核苷脫氨酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發明通過構建表達一種重組的嘌呤核苷脫氨酶的工程菌，以及嘗試以鳥嘌呤核苷作為底物，該底物經工程酶催化，進而獲得黃嘌呤核苷。本發明的工藝方法與化學合成相比，具有成本低、轉化率高、工藝簡單、安全且環保綠色的優勢，可以大幅度擴展黃嘌呤核苷的應用空間。

技術研發人員：張勝南,陳小玲,吳子豪,周金鳳,歐淑芳,賓桂青,魯立,郭鵬程,張織,歐雅莉
受保護的技術使用者：廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2025/3/20