本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種三疣梭子蟹的5-htr1基因及其應用。

背景技術：

1、5-羥色胺(5-hydroxy?tryptamine，5-ht)是一種抑制性神經遞質，廣泛分布于甲殼動物中樞和外周神經組織中，通過影響神經內分泌系統中神經激素的合成與釋放能夠間接對多種生理作用和行為進行調控。5-羥色胺受體(5-hydroxy?tryptamine?receptor，5-htr)是細胞膜上與5-羥色胺相結合的一類跨膜蛋白。研究發現，5-ht及其受體在動物的生理過程中發揮著及其重要的作用。5-ht必須與相應的受體結合才能發揮作用，在相應受體的介導下，參與調控攻擊、攝食、認知、社會等級和情緒調節等多種行為。

2、三疣梭子蟹是我國主要的海洋捕撈蟹類，生性好斗，打斗行為使其種內互相殘殺現象極其嚴重，打斗造成斷肢蟹的出現，進而影響蟹的存活、生長和品質，增加養殖成本。目前研究表明，三疣梭子蟹的打斗行為與5-ht水平有關；在應激源的誘導下，三疣梭子蟹會出現適應性的生理變化，刺激5-ht的釋放和轉換，并通過介導相應的受體，進而參與調節動物的應激、內分泌和情緒反應等一系列行為表現。5-ht水平異常引起神經遞質-受體信號通路的適應性改變并導致大腦功能紊亂，與焦慮癥的發病機制密切相關并廣泛存在于與哺乳動物焦慮相關的腦區。

3、目前有關三疣梭子蟹5-ht1功能及其受體5-htr1的研究尚未見報道，為此有必要對5-ht1參與三疣梭子蟹的行為機制作進一步的研究。

技術實現思路

1、本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種5-htr1基因。

2、本發明所要解決的第二個技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種5-htr1基因的應用。

3、本發明解決第一個技術問題所采用的技術方案為:該5-htr1基因，其特征在于:該5-htr1基因為pt5-htr1，所述pt5-htr1的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4、進一步地，所述5-htr1基因的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

5、本發明還提供一種克隆上述的5-htr1基因的方法，其特征在于:包括以下步驟:

6、(1)根據轉錄組序列信息設計特異性引物，以三疣梭子蟹cdna為模板，通過pcr擴增得到5-htr1的表達序列標簽(est)，將得到的est片段與載體連接，克隆并測序；

7、(2)根據5-htr1的表達序列標簽(est)，分別設計5-htr1?3’race上游引物和5’race下游引物，以race?cdna第一鏈為模板，利用cdna末端快速擴增(race)獲得3’和5’末端片段race，將得到的3’和5’末端片段分別與載體連接，克隆并測序；

8、(3)將測序得到的3’和5’末端片段與5-htr1的est序列進行拼接獲得5-htr1的cdna全長序列。

9、進一步地，所述的5-htr1的est序列上游引物和下游引物的核苷酸序列如seq?idno:3和seq?id?no:4所示:

10、seq?id?no:3為5-htr1-est-f:cttgctttggacgcctacga；

11、seq?id?no:4為5-htr1-est-r:ggaggtgagttgagctgga。

12、進一步地，所述的5-htr1的3’race上游引物的核苷酸序列如seq?id?no:5和seqid?no:6所示:

13、seq?id?no:5為5-htr1-3’race-f:ctatcaggacgcagccagtgcaccaa；

14、seq?id?no:6為5-htr1-3’race-r:ctggaagaggaagggttacttac。

15、進一步地，所述的5-htr1的5’race下游引物的核苷酸序列如seq?id?no:7和seqid?no:8所示:

16、seq?id?no:7為5-htr1-5’race-f:cttgctttggacgcctacga；

17、seq?id?no:8為5-htr1-5’race-r:ggaggtgagttgagctgga。

18、進一步地，所述的5-htr1基因的特異性引物的核苷酸序列如seq?id?no:9和seqid?no:10所示:

19、seq?id?no:9為5-htr1-f:cgccgccttcatcagtttgc；

20、seq?id?no:10為5-htr1-r:gcctgtgccttacgctcct。

21、本發明還提供一種制備探針的方法，其特征在于，包括有以下步驟:

22、1)根據如權利要求1所述的pt5-htr1進行引物設計并擴增；

23、2)將所述步驟1)得到的擴增產物與pspt18雙向轉錄載體連接，進行重組質粒的構建；

24、3)對所述步驟2)的質粒進行測序，待測序正確后，采用sp6啟動子引物和t7啟動子引物進行擴增，乙醇沉淀后進行體外轉錄，獲得正義和反義探針。

25、進一步地，所述引物的核苷酸序列如seq?id?no:11和seq?id?no:12所示:

26、seq?id?no:11為正向引物的序列:ctgagctttgtgacatgtggactt；

27、seq?id?no:12為反向引物的序列:gatcttccagtacaggatgaggat。

28、本發明還提供一種檢測方法，其特征在于，包括有以下步驟:

29、s1逆轉錄:以飽食狀態的三疣梭子蟹作為陽性對照組，以待檢測的三疣梭子蟹作為待檢測組，分別對陽性對照和待檢測對象的肌肉、神經節、肝臟的任一組織中提取總rna后逆轉錄得到陽性對照和待檢測組的cdna；

30、s2擴增信號檢測:采用rt-pcr技術對所述步驟s1得到的兩組cdna進行擴增，擴增采用的正向引物為如權利要求7所述的5-htr1-f，反向引物為如權利要求7所述的5-htr1-r，擴增完成后收集熒光信號后計算得到陽性對照和待檢測組中5-htr1的相對表達水平；

31、s3對比分析:將得到的陽性對照和待檢測組的5-htr1的相對表達水平進行顯著性分析。

32、本發明還提供了上述的5-htr1基因的啟動子，其特征在于：所述5-htr1基因為pt5-htr1，所述pt5-htr1的核苷酸序列如seq?id?no:1所示，而對應啟動子的核苷酸序列如seq?id?no:13所示。為解決第二個技術問題，本發明還提供5-htr1基因的應用。

33、與現有技術相比，本發明的優點在于：本發明首次克隆出了5-htr1基因并得到了5-htr1基因的核苷酸序列，根據5-htr1序列特征成功將利用原位雜交技術將三疣梭子蟹5-htr1基因定位在三疣梭子蟹組織上，并作了相關的表達分析，同時分析了三疣梭子蟹在饑餓的情況下不同組織中5-htr1基因表達差異，分析驗證，表明了5-ht1參與三疣梭子蟹的行為機制，有助于揭示三疣梭子蟹的行為及生理適應策略，在抗焦慮等新一類藥物開發及三疣梭子蟹的精細化養殖管理方面具有良好的應用前景。