本發(fā)明涉及亞胺還原酶突變體及其在合成手性1，3-二取代四氫異喹啉中的應(yīng)用，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、四氫異喹啉(thiq)生物堿是目前規(guī)模最大的天然產(chǎn)物之一，在藥物研發(fā)中占有不可或缺的地位。近幾十年來(lái)thiq類(lèi)天然產(chǎn)物已被深入研究，其具有廣泛的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性。

2、在這些不同的thiq中，至少有兩個(gè)手性碳中心的1,3-二取thiq是一種特殊的thiq生物堿，區(qū)別于人們普遍認(rèn)為通過(guò)醛和芳香族氨基酸衍生的芳基乙胺之間的pictet-spengler(p-s)反應(yīng)形成的四氫異喹啉，是由醋酸-丙二酸途徑形成的聚酮類(lèi)化合物進(jìn)一步反應(yīng)生成，該途徑涉及尚未確定的聚酮合成酶和其它酶。然而，1，3-二取代thiq不尋常的取代模式，特別在c1和c3位置存在甲基，由于難以通過(guò)生物催化在芳香氨基酸預(yù)安裝α-甲基以構(gòu)建c3甲基和ncs底物限制乙醛構(gòu)建c1甲基，這些重要化合物通過(guò)傳統(tǒng)的p-s路徑存在巨大的障礙。

3、盡管它們的生物合成仍然具有挑戰(zhàn)性，但許多開(kāi)創(chuàng)性的化學(xué)合成方法已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)構(gòu)建這些有價(jià)值的手性結(jié)構(gòu)，包括過(guò)渡金屬催化的1,3-二取代異喹啉的不對(duì)稱(chēng)還原、手性3,4-二氫異喹啉的不對(duì)稱(chēng)親核加成、手性四氫異喹啉的烷基化反應(yīng)、手性苯乙胺衍生物與醛類(lèi)之間的p-s反應(yīng)，手性酰化苯乙胺bischler-napieralski(b-n)/還原級(jí)聯(lián)反應(yīng)和鈀催化三組分catellani/金催化環(huán)化/還原級(jí)聯(lián)反應(yīng)。盡管這些策略是有效的，但它們往往依賴(lài)于具有預(yù)先構(gòu)建手性中心的復(fù)雜底物、重金屬催化劑、易燃和危險(xiǎn)的氫氣，以及高溫和高壓的惡劣條件。因此，開(kāi)發(fā)一種新穎的、高效的、綠色的方法，從簡(jiǎn)單的非手性底物構(gòu)建手性1,3-二取代thiq是非常可取的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了亞胺還原酶突變體，以氨基酸序列如seq?id?no.3所示的亞胺還原酶為親本，具有(a)-(f)中一個(gè)或多個(gè)突變：

2、(a)將親本第123位蘇氨酸突變?yōu)楸彼幔?/p>

3、(b)將親本第124位脯氨酸突變?yōu)楸彼幔?/p>

4、(c)將親本第175位亮氨酸突變?yōu)楸彼幔?/p>

5、(d)將親本第216位甲硫氨酸突變?yōu)楸彼幔?/p>

6、(e)將親本第223蘇氨酸突變?yōu)楸彼幔?/p>

7、(f)將親本第245位甲硫氨酸突變?yōu)楸彼帷?/p>

8、本發(fā)明還提供了編碼所述亞胺還原酶突變體的基因。

9、本發(fā)明還提供了攜帶所述基因的重組質(zhì)粒。

10、本發(fā)明還提供了表達(dá)所述亞胺還原酶突變體的重組微生物。

11、在一種實(shí)施方式中，所述微生物包括但不限于大腸桿菌。

12、在一種實(shí)施方式中，以大腸桿菌(escherichia?coli)bl21(de3)為宿主，以pet-21b(+)為載體，表達(dá)所述亞胺還原酶突變體。

13、本發(fā)明還提供了制備所述亞胺還原酶突變體的方法。

14、在一種實(shí)施方式中，所述方法是將表達(dá)所述轉(zhuǎn)氨酶的重組大腸桿菌接種至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)菌株至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，誘導(dǎo)，收集菌體，重懸，破碎，離心收集裂解液，純化酶蛋白。

15、本發(fā)明還提供了含有所述亞胺還原酶突變體的酶制劑。

16、本發(fā)明還提供了所述亞胺還原酶突變體在合成1,3-二取代thiq的應(yīng)用。

17、在一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用包括以下步驟：

18、(1)將所述轉(zhuǎn)氨酶蛋白與底物在乳酸脫氫酶(ldh)循環(huán)系統(tǒng)的參與下進(jìn)行混合反應(yīng)，制備胺2；所述底物為酮類(lèi)1，d-丙氨酸或l-丙氨酸，磷酸吡哆醛(plp)；所述ldh循環(huán)系統(tǒng)包括乳酸脫氫酶(ldh)、葡萄糖脫氫酶(gdh)、nadh、葡萄糖；

19、(2)將步驟(1)所得胺2與酰氯進(jìn)行反應(yīng)，收集反應(yīng)產(chǎn)物，再將所得產(chǎn)物與三氯氧磷反應(yīng)，獲得亞胺3；

20、(3)將步驟(2)所得亞胺3作為底物，以亞胺還原酶蛋白和gdh循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行催化反應(yīng)，得到1,3-二取代thiq；所述gdh循環(huán)系統(tǒng)包括gdh、nadp+、葡萄糖。

21、在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)氨酶來(lái)源于arthrobacter?sp.，其氨基酸序列如seqid?no.1所示。

22、在一種實(shí)施方式中，所述葡萄糖脫氫酶來(lái)源于枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，其氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

23、在一種實(shí)施方式中，所述乳酸脫氫酶來(lái)源于發(fā)酵乳桿菌(lactobacillusfermentum)jn248，其氨基酸序列如seq?id?no.7所示。

24、在一種實(shí)施方式中，所述步驟(3)中亞胺3的添加量為1mm，所述亞胺還原酶突變體的添加量為1.6-3mol％，所述gdh的添加量為1mol％，所述nadp+的添加量為10mol％，所述葡萄糖的添加量為100mm；其中，所有摩爾百分比均基于底物亞胺3計(jì)算。

25、在一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)的反應(yīng)體系中含有0.5m胺2溶于二氯甲烷，1.5當(dāng)量三乙胺，至少1當(dāng)量酰氯，0.5m酰胺溶于乙腈，5當(dāng)量三氯氧磷；所述乙腈優(yōu)選干燥的乙腈；所述三氯氧磷優(yōu)選新鮮蒸餾三氯氧磷。

26、在一種實(shí)施方式中，所述步驟(2)中反應(yīng)溫度均為90℃。

27、在一種實(shí)施方式中，所述底物包括酮類(lèi)1，d-丙氨酸或l-丙氨酸，磷酸吡哆醛(plp)。

28、在一種實(shí)施方式中，所述ldh循環(huán)系統(tǒng)包括ldh、葡萄糖脫氫酶(gdh)、nadh、葡萄糖。

29、在一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)的溫度為20-40℃，所述反應(yīng)的ph為7.0-8.0。

30、在一種實(shí)施方式中，所述反應(yīng)的時(shí)間為12-24h，或所述反應(yīng)的時(shí)間為不低于12h。

31、在一種實(shí)施方式中，所述酮類(lèi)1的添加量為5-10mm；所述d-丙氨酸或l，丙氨酸添加量為100mm，所述plp添加量為1mm，所述葡萄糖添加量為100mm，所述nadh添加量為1mm。

32、在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)氨酶的添加量為0.2-0.4mol％，所述gdh的添加量為0.15-0.3mol％，所述ldh的添加量為0.03-0.06mol％，其中，所有摩爾百分比均基于底物酮類(lèi)1計(jì)算。

33、在一種實(shí)施方式中，所述酮類(lèi)1的添加量為5-10mm；所述d-丙氨酸或l-丙氨酸添加量為100mm，所述plp添加量為1mm，所述葡萄糖添加量為100mm，所述nadh添加量為1mm。

34、在一種實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)氨酶的添加量為0.2-0.4mol％，所述gdh的添加量為0.15-0.3mol％，所述ldh的添加量為0.03-0.06mol％。

35、在一種實(shí)施方式中，所述酮類(lèi)1包括以下1a-1d,1f至少一種：

36、

37、在一種實(shí)施方式中，所述酰氯包括以下a-g至少一種：

38、

39、在一種實(shí)施方式中，所述亞胺3包括以下3a-3l至少一種：

40、

41、在一種實(shí)施方式中，所述1，3-二取代thiq結(jié)構(gòu)如下：

42、

43、本發(fā)明還提供了所述亞胺還原酶突變體或所述編碼所述亞胺還原酶酶突變體的基因，或表達(dá)所述突變體的重組細(xì)胞在合成1，3-二取代thiq中的應(yīng)用。

44、本發(fā)明還提供了所述突變體，或所述重組細(xì)胞，或所述方法在制備1，3-二取代thiq的應(yīng)用。

45、有益效果：

46、(1)本發(fā)明篩選了不同來(lái)源的亞胺還原酶，其中，亞胺還原酶snir可以將底物外消旋亞胺轉(zhuǎn)化為(1s，3r)-4a，轉(zhuǎn)化率為11％，de值44，ee值59％；

47、(2)本發(fā)明在篩選獲得的亞胺還原酶snir的基礎(chǔ)是進(jìn)行了突變，構(gòu)建的亞胺還原酶突變體snir-l175a/m245a可以將底物外消旋亞胺轉(zhuǎn)化為(1s，3r)-4a，轉(zhuǎn)化率為50％，de值>99％，ee值>99％；

48、(3)本發(fā)明還提供了一種以亞胺為原料合成1，3-二取代thiq的方法，(1s,3r)-4a-(1s,3r)-4l的hplc產(chǎn)率分別為85％,83％,92％,36％,98％,68％,92％,95％,84％,95％,99％,99％。de值分別為>99％,>99％,>99％,>99％,>99％,99％,>99％,99％,>99％,>99％,>99％,>99％。ee值分別為>99％,>99％,97％,>99％,>99％,>99％,97％,>99％,>99％,>99％,>99％,>99％。

49、(4)本發(fā)明的方法，以酮1a為原料化學(xué)酶模塊化級(jí)聯(lián)合成179.8mg的(1s,3r)-4a，產(chǎn)率為81％，>99de，>99ee。