本發(fā)明屬于重組蛋白及其應(yīng)用，具體涉及一種sa-tim4蛋白及其制備方法和在分離外泌體中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體是細(xì)胞通過自分泌或者旁分泌等方式形成的細(xì)胞外囊泡，直徑大小約為30～150nm，含有豐富的dna、rna、蛋白質(zhì)等參與細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等，可用于疾病診斷與治療、藥物遞送以及組織修復(fù)等方面，因此，外泌體在食品、醫(yī)學(xué)、制藥和生物等領(lǐng)域具有廣闊的研究前景。

2、外泌體的分離技術(shù)是制約外泌體廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵，高效便攜、高純度、大規(guī)模的制備技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。現(xiàn)有的外泌體分離技術(shù)主要集中在利用密度差異、密度差異、溶解性以及流體性質(zhì)進(jìn)行分離，存在分離純度低，設(shè)備要求高，耗時長等問題。與之相比的免疫反應(yīng)的親和分離技術(shù)，利用抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)可特異性分離外泌體。中國專利cn113046303a《一種外泌體分離的快速提取試劑盒》和中國專利cn111849903a《一種從細(xì)胞上清液中分離外泌體的試劑盒及其使用方法》中都提到了采用timd4重組蛋白、timd3重組蛋白或annexinv重組蛋白作為識別和結(jié)合外泌體的成分。但是timd4重組蛋白、timd3重組蛋白或annexinv重組蛋白的相對特異性不足，本身的結(jié)合靶點(diǎn)相對固定，難以方便地與各種生物素標(biāo)記的物質(zhì)進(jìn)行組合和調(diào)整，造成功能化修飾過程復(fù)雜，后續(xù)檢測和分析方面的配套技術(shù)相對較少，需要進(jìn)一步的研究改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是目前利用抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)可特異性分離外泌體的技術(shù)抗原與抗體結(jié)合時間較長，結(jié)合與洗脫的條件較為嚴(yán)苛，并且制備抗體的成本較高，給大規(guī)模的生產(chǎn)與制備帶來了挑戰(zhàn)。

2、針對現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種sa-tim4蛋白及其制備方法和在分離外泌體中的應(yīng)用，可以高效制備sa-tim4，克服了現(xiàn)有分離技術(shù)生產(chǎn)成本高的問題，并打破了傳統(tǒng)外泌體分離技術(shù)耗時、設(shè)備和反應(yīng)條件要求高和難以大規(guī)模分離的局限性。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本使用發(fā)明的技術(shù)方案是：一種sa-tim4蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、seq?id?no.1：

5、mskgllllwlvtelwwlyltpaasedtiigflgqpvtlpchylswsqsrnsmcwgkgscpnskcnaellrtdgtriisrkstkytllgkvqfgevsltisntnrgdsgvyccrievpgwfndvkknvrlelrratttkkpttttrptttpyvttttpellpttvmttsvlptttppqtlattafstavttcpsttpgsfsqettkgsafttesetlpasnhsqrsmmtistdiavlrptgsnpgilpstsqlttqkttlttseslqkttkshqinsrqtiliiaccvgfvlmvllflafllrgkvtganclqrhkrpdntedsdsvlndmshgrddedgiftlmrkivvaaiavslttvsitasasadpskdskaqvsaaeagitgtwynqlgstfivtagadgaltgtyesavgnaesryvltgrydsapatdgsgtalgwtvawknnyrnahsattwsgqyvggaearintqwlltsgtteanawkstlvghdtftkvkpsaasidaakkagvnngnpldavqq。

6、一種制備上述sa-tim4蛋白的方法，使用畢赤酵母x-33和大腸桿菌bl21表達(dá)純化制備。

7、一種sa-tim4功能化的磁納米顆粒，其制備方法包括以下步驟：

8、(1)制備磁納米顆粒mnp；

9、(2)制備二氧化硅功能化的磁納米顆粒mnp@si；

10、(3)制備氨基功能化的磁納米顆粒mnp@nh2；

11、(4)制備生物素功能化的磁納米顆粒mnp@biotin；

12、(5)制備sa-tim4功能化的磁納米顆粒mnp-biotin@sa-tim4。

13、進(jìn)一步的，步驟(1)制備磁納米顆粒為：將1.5g六水合三氯化鐵、3.5g無水乙酸鈉、1ml聚乙烯亞胺溶于40ml乙二醇中，在室溫下攪拌2h，轉(zhuǎn)子3cm、轉(zhuǎn)速為200r/min；待藥品完全溶解，混合液呈現(xiàn)出棕褐色時，將混合液倒入50ml聚四氟乙烯內(nèi)膽中，然后將內(nèi)膽放入高壓反應(yīng)釜中，擰緊后放入馬弗爐中，在220℃下反應(yīng)8h；反應(yīng)結(jié)束后，將高壓反應(yīng)釜取出，在室溫下降溫至環(huán)境溫度，然后將混合液倒入500ml燒杯中，用強(qiáng)磁鐵隔燒杯壁吸附納米磁珠，用無水乙醇和超純水分別清洗6次，待洗滌液澄清透明后，將納米磁珠存放在無水乙醇中，記為mnp。

14、進(jìn)一步的，步驟(2)制備二氧化硅功能化的磁納米顆粒為：將100mg?mnp磁珠分散在140ml乙醇水溶液(乙醇：水＝6：1，v/v)中，超聲分散處理40min，然后加入2ml氨水(25％水溶液)；將混合液倒入250ml圓底燒瓶中，并加入20枚玻璃珠(粒徑1mm)，將圓底燒瓶固定在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在室溫下180r/min攪拌20min，在此過程中逐滴加入2ml四乙氧基硅烷，然后在室溫下180r/min攪拌3h；反應(yīng)結(jié)束后，用強(qiáng)磁鐵隔燒瓶壁吸附納米磁珠，用無水乙醇和超純水分別清洗3次，然后將納米磁珠存放在無水乙醇中，記為二氧化硅功能化的的磁珠mnp@si。

15、進(jìn)一步的，步驟(3)制備氨基功能化的磁納米顆粒為：將450mg的mnp@si超聲分散在150ml的aptes-乙醇溶液(4％，v/v)中；將混合液倒入250ml圓底燒瓶中，并加入20枚玻璃珠(粒徑1mm)，將圓底燒瓶固定在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，在室溫下180r/min攪拌3h；反應(yīng)結(jié)束后，用強(qiáng)磁鐵隔燒瓶壁吸附納米磁珠，用無水乙醇和超純水分別清洗3次，然后將納米磁珠存放在無水乙醇中，記為氨基功能化的磁納米顆粒mnp@nh2。

16、進(jìn)一步的，步驟(4)制備生物素功能化的磁納米顆粒為：將240mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和200mg的n-羥基琥珀酰亞胺溶于40ml的pbs溶液(0.01m，ph7.4)中，在室溫下攪拌20min后，加入1ml生物素pbs水溶液(1mg/ml)，在室溫下攪拌1h后，加入500mg的mnp@nh2，將混合物倒入50ml離心管中，在4℃條件下攪拌12h。反應(yīng)結(jié)束后，用強(qiáng)磁鐵隔離心管壁吸附納米磁珠，用pbs清洗3次，然后將納米磁珠存放在pbs中，記為生物素功能化的磁納米顆粒mnp@biotin。

17、進(jìn)一步的，步驟(5)制備sa-tim4功能化的磁納米顆粒為：將500mg的mnp@biotin加入到含有sva-tim4的pbs中，將混合物倒入50ml離心管中，在4℃條件下攪拌6h；反應(yīng)結(jié)束后，用強(qiáng)磁鐵隔離心管壁吸附納米磁珠，用pbs清洗3次，然后將納米磁珠存放在pbs中，記為sa-tim4功能化的磁納米顆粒mnp-biotin@sa-tim4。

18、上述sa-tim4蛋白或sa-tim4功能化的磁納米顆粒在分離外泌體中的應(yīng)用。

19、一種利用上述sa-tim4蛋白分離、提取外泌體的方法，利用sa-tim4結(jié)合生物素修飾納米磁珠得到sa-tim4功能化的磁納米顆粒，通過tim4與外泌體表面的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合與釋放進(jìn)行外泌體分離。所述生物素修飾的納米磁珠可從雜蛋白中特異性結(jié)合sa-tim4。sa-tim4是由t細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白(t?cell?immunoglobulin?mucin?4，tim4)和鏈霉親和素(streptavidin，sa)組合的重組蛋白結(jié)合生物素修飾的納米磁珠進(jìn)行制備，利用tim4與外泌體表面的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合與釋放分離外泌體。sa在外泌體分離材料中起到了連接親和配基tim4和基質(zhì)mnp@biotin的作用，生物素(biotin)在sa上的結(jié)合位點(diǎn)主要由sa的色氨酸殘基組成。這種結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性使得mnp@biotin上的biotin能夠精確且簡便地嵌入到sa的結(jié)合位點(diǎn)中，從而將mnp@biotin與sa-tim4在生理體系下快速偶聯(lián)在一起，制備成科高校識別外泌體的親和介質(zhì)。

20、進(jìn)一步的，包括以下步驟：準(zhǔn)確稱取0.2g的sa-tim4功能化的磁納米顆粒裝入50ml離心管中。用3mlpbs平衡液(0.01m，ph?7.4)洗滌mnp-biotin@sa-tim4，重復(fù)3次后，等待上樣；將40ml經(jīng)0.22μm過濾器過濾后的樣品提取液加入離心管中，然后在4℃下震蕩30min；吸附結(jié)束后，用強(qiáng)磁鐵隔離心管將mnp-biotin@sa-tim4固定，倒掉樣品提取液。然后加入3mlpbs平衡液，震蕩1min后，用強(qiáng)磁鐵隔離心管將mnp-biotin@sa-tim4固定，倒掉pbs平衡液，重復(fù)2次以去除非特異性結(jié)合的外泌體。最后加入2ml的洗脫液(pbs，0.01m，ph?7.4；edta-na2，2mm)，震蕩5min后，用強(qiáng)磁鐵隔離心管將mnp-biotin@sa-tim4固定，取洗脫液(該洗脫液中富含外泌體顆粒)并保存在4℃中。

21、本發(fā)明的有益效果為：

22、本發(fā)明通過酵母和大腸工程菌制備sa-tim4能與生物素修飾的納米磁珠特異性結(jié)合，再利用tim4與外泌體表面的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合與分離，實(shí)現(xiàn)了高效分離外泌體。與超速離心、密度梯度離心、超濾、尺寸排阻色譜、聚合物沉淀和微流控等方法相比，省去對設(shè)備的依賴，去除化學(xué)試劑工藝的繁瑣和節(jié)約了成本，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模綠色、環(huán)保、高效性制備，具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛質(zhì)。