本發明涉及酶基因工程領域，具體是一種高活力的納豆激酶突變體及其應用。

背景技術：

1、納豆激酶（nattokinase，nk）是一種纖溶酶，具有溶解血栓和預防血栓形成的作用。尿激酶，組織型纖溶酶原激活劑和鏈激酶作為傳統溶栓藥物，雖然具有一定功效，但它們通常伴隨高成本、特異性缺乏及嚴重出血并發癥的風險。納豆激酶作為一種可以口服并被人體吸收的天然蛋白質生物活性物質，成本低、毒性小、療效持久且無明顯副作用，展現出作為治療和預防手段的潛力，逐漸被用于血栓預防及功能性食品。隨著納豆激酶的廣泛應用，對其高效生產提出了更高的要求。通過微生物生產納豆激酶，能夠在較短時間內獲得較高產量，并有效降低生產成本。

技術實現思路

1、本發明的目的在于提供一種高活力的納豆激酶突變體，以解決上述背景技術中提出的問題，其具有在酶活性方面表現出顯著提高的優點。

2、為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種高活力的納豆激酶突變體，所述突變體是氨基酸序列為seq?id?no:2?的納豆激酶突變體，所述納豆激酶突變體為在自n端起第365位置處突變，其突變為氨基酸n至s的突變。

3、作為本發明進一步的方案：編碼權利要求1所述的納豆激酶突變體的基因。

4、作為本發明再進一步的方案：包含權利要求2所述基因的表達載體。

5、作為本發明再進一步的方案：用于表達含有seq?id?no.?2所示蛋白的重組微生物。

6、本發明的另一個目的是提供一種納豆激酶突變體的制備方法，包括將編碼seq?idno.?2所示蛋白的基因插入表達載體并轉化到枯草芽孢桿菌（bacillus?subtilis?168）進行發酵表達。

7、本發明的另一個目的是提供納豆激酶單點突變體的應用。

8、與現有技術相比，本發明的有益效果是：

9、1、本發明提出了一種納豆激酶突變體，通過將n365s突變引入至枯草芽孢桿菌wb800n表達系統中，獲得了酶活性顯著提高的納豆激酶變體。經測定，本突變體的纖溶酶活性較野生型提高了110.60%；

10、2、通過測量纖溶圈的直徑和檢測pna的釋放量，綜合評估n365s突變體的酶活性。釋放的pna量越多，表示酶對底物的水解效率越高，因此活性越強。結果表明，n365s突變體的酶活性較野生型提高了1.1倍，顯示出在溶栓應用中的顯著潛力；

11、3、通過graphpad?prism軟件對各突變體的纖溶活性測定數據進行統計分析，包括測量的纖溶圈的直徑，以在405?nm的吸光度變化測量?pna?生成量，pna釋放量的高低直接反映了酶活性的強弱，以驗證n365s突變體在酶活性提升方面的顯著效果，結果表明，n365s突變體在纖溶活性方面的提升了1.1倍，為纖溶酶的進一步應用奠定了基礎；

12、4、顯著提升的酶活性：通過n365s突變實現酶活性的1.1倍的提升，有效增強了納豆激酶的纖溶活性；

13、5、應用潛力廣泛：由于該突變體在纖溶效果方面具有優勢，適用于血栓溶解，有助于在溶栓藥物領域拓展納豆激酶的應用。

技術特征：

1.一種高活力的納豆激酶突變體，其特征在于：所述突變體是氨基酸序列為seq?idno:2?的納豆激酶突變體，所述納豆激酶突變體為自n端起在第365位置處的n至s的突變。

2.編碼權利要求1所述的納豆激酶突變體的基因。

3.包含權利要求2所述基因的表達載體。

4.用于表達含有seq?id?no.?2所示蛋白的重組微生物。

5.一種權利要求1所述的納豆激酶突變體的制備方法，包括將編碼seq?id?no.?1所示蛋白的基因插入表達載體并轉化到枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis?168進行發酵表達。

6.根據權利要求1所述的納豆激酶單點突變體的應用。

技術總結
本發明公開了一種具有高活力的N365S突變納豆激酶及其應用，本發明針對野生型納豆激酶，在其365位氨基酸處引入N至S的突變，所得的納豆激酶突變體酶活性提高了110.60%，相較于野生型納豆激酶，該突變體顯示出更強的纖溶活性。本發明為納豆激酶的大規模生產提供了理論基礎。

技術研發人員：張波,周璇,陳晨,蔣晉陽,鐘玘楨
受保護的技術使用者：溫州肯恩大學（Wenzhou-Kean University）
技術研發日：
技術公布日：2025/4/28