本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及脯氨酸羥化酶突變體及其在羥脯氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用和方法。

背景技術(shù)：

1、羥脯氨酸(hyp)，為亞氨基酸細(xì)分產(chǎn)品，是一種非必需氨基酸，是膠原組織的主要成分之一，且為膠原中特有的氨基酸，約占膠原氨基酸總量的13％。羥脯氨酸用途廣泛，在食品、化妝品、膳食補(bǔ)充劑、醫(yī)藥等領(lǐng)域擁有廣闊應(yīng)用前景。在食品領(lǐng)域，羥脯氨酸可用作蛋糕、面包、果汁、調(diào)味醬、冰淇淋等產(chǎn)品的食品添加劑，能夠提升食物口感、提高原材料利用率；在醫(yī)藥領(lǐng)域，羥脯氨酸能夠治療關(guān)節(jié)炎、合成人體所需膠原蛋白。羥脯氨酸制備方法包括微生物發(fā)酵法、蛋白水解提取法、化學(xué)合成法三種，由于化學(xué)合成法存在生產(chǎn)成本高、操作復(fù)雜等問(wèn)題，尚未實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，因此蛋白水解提取法為羥脯氨酸主流制備方法，但由于這種制備方法的生產(chǎn)成本較高限制了大規(guī)模應(yīng)用，因此亟待開發(fā)成本更低的生產(chǎn)方式。

2、微生物發(fā)酵法主要是利用微生物菌株的生物合成途徑來(lái)生產(chǎn)羥脯氨酸，其優(yōu)勢(shì)在于以糖質(zhì)為原料，符合食用習(xí)慣，生產(chǎn)成本低、效益高，特別是目前基因工程育種技術(shù)及高產(chǎn)優(yōu)化控制技術(shù)的采用，使發(fā)酵法生產(chǎn)成本大大降低，利用代謝工程和基因工程方法改造菌株，使其生產(chǎn)對(duì)人類有利產(chǎn)品的技術(shù)越來(lái)越成熟，優(yōu)勢(shì)更為明顯。但是由于脯氨酸羥化酶p4h的酶活較低，使得發(fā)酵終產(chǎn)物羥脯氨酸中混了一定比例的脯氨酸，無(wú)法繼續(xù)提高羥脯氨酸產(chǎn)量，也增加了下游純化工藝的難度，難獲得高純度的羥脯氨酸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種脯氨酸羥化酶突變體，該突變體可以提高羥脯氨酸產(chǎn)量，同時(shí)還降低了脯氨酸含量。本發(fā)明首次報(bào)道了p4h點(diǎn)突變能提高h(yuǎn)yp的產(chǎn)量。

2、一方面，本發(fā)明提供了一種脯氨酸羥化酶突變體，所述脯氨酸羥化酶突變體在序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上突變；所述突變位點(diǎn)選自s85、d122、h125、v126、g141、s211、或s205中的一個(gè)或多個(gè)。

3、seq?id?no.1：

4、atgctgactccaaccgaactgaaacaatatcgtgaagctggctatctgctgattgaggatggtctgggccctcgcgaagtggactgcctgcgccgtgcagcggcggctctgtacgctcaggatagccctgaccgtaccctggaaaaggacggtcgtaccgttcgtgctgtccacggttgccaccgccgcgacccggtttgccgtgatctggttcgtcaccctcgtctgctgggtccagctatgcaaatcctgtccggcgacgtttacgtgcaccagttcaagatcaacgcgaaggctcctatgaccggtgatgtctggccttggcaccaggattacatcttttgggcacgcgaagatggcatggaccgcccgcatgtggttaacgtggctgttctgctggatgaggcaactcacctgaacggtcctctgctgttcgttccaggcacccacgaactgggcctgattgacgttgagcgccgtgctccagccggtgacggcgatgcacagtggctgccacagctgagcgcagacctggactacgctatcgatgccgacctgctggctcgcctgaccgcaggccgcggtattgaaagcgcaactggcccagccggctctatcctgctgtttgactcccgcatcgtgcacggttccggcactaacatgagcccgcatccgcgcggtgtggttctggtcacctacaaccgcactgacaatgcgctgccagcacaggctgcgcctcgtcctgagttcctggcggctcgcgacgcaaccccactggtgccgctgccagcaggcttcgcactggctcaaccggtgtaa。

5、進(jìn)一步具體地，序列seq?id?no.1所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為seq?id?no.6。

6、seq?id?no.6：

7、mltptelkqyreagylliedglgprevdclrraaaalyaqdspdrtlekdgrtvravhgchrrdpvcrdlvrhprllgpamqilsgdvyvhqfkinakapmtgdvwpwhqdyifwaredgmdrphvvnvavlldeathlngpllfvpgthelglidverrapagdgdaqwlpqlsadldyaidadllarltagrgiesatgpagsillfdsrivhgsgtnmsphprgvvlvtynrtdnalpaqaaprpeflaardatplvplpagfalaqpv*。

8、具體地，所述突變位點(diǎn)包括半飽和突變和/或飽和突變。

9、優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)可以是飽和突變。

10、具體地，所述突變位點(diǎn)可以選自s85g、s85n、s85r、s85e、s85q、s85d、s85a、d122a、h125a、h125s、h125t、v126a、v126n、v126t、g141a、g141t、g141r、g141q、g141s、s205a和s211a中的一個(gè)或多個(gè)。

11、優(yōu)選地，所述突變位點(diǎn)可以選自s85q、s85a、v126a、v126t、h125s、h125t、g141a、s85q-v126a(s85q和v126a兩個(gè)位點(diǎn)的組合)、s85a-v126t、g141a-h125s或g141a-h125t。

12、又一方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述的核酸分子編碼前述的脯氨酸羥化酶突變體。

13、又一方面，本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒，包括前述的核酸分子。

14、又一方面，本發(fā)明提供了包含前述的核酸分子或重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

15、具體地，所述宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。

16、進(jìn)一步具體地，所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞。

17、優(yōu)選地，所述原核細(xì)胞包括但不限于：大腸桿菌、假單胞菌、芽孢桿菌、鏈球菌或放線菌。

18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述原核細(xì)胞可以是大腸桿菌。

19、又一方面，本發(fā)明提供了一種提高羥脯氨酸產(chǎn)量和/或純度的方法，通過(guò)前述的宿主細(xì)胞發(fā)酵獲得。

20、又一方面，本發(fā)明提供了前述的脯氨酸羥化酶突變體或核酸分子或宿主細(xì)胞在制備羥脯氨酸中的應(yīng)用。

21、又一方面，本發(fā)明提供了前述的脯氨酸羥化酶突變體或核酸分子或宿主細(xì)胞在制備化妝品或藥物中的應(yīng)用。

22、本發(fā)明所取得的技術(shù)效果：

23、本發(fā)明首次提出了p4h位點(diǎn)突變可顯著提高羥脯氨酸(hyp)的含量以及占比，突變位點(diǎn)包括但不限于：g141、s205、s211、h125、d122、s85或v126。以上位點(diǎn)可以是半飽和突變或飽和突變，且上述位點(diǎn)還可以兩兩組合進(jìn)行突變，均可提高h(yuǎn)yp產(chǎn)量和純度。

技術(shù)特征：

1.一種脯氨酸羥化酶突變體，其特征在于，所述脯氨酸羥化酶突變體在序列seq?idno.1的基礎(chǔ)上突變；所述突變位點(diǎn)選自g141、s205、s211、h125、d122、s85或v126中的一個(gè)或多個(gè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脯氨酸羥化酶突變體，其特征在于，所述突變位點(diǎn)包括半飽和突變和/或飽和突變。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脯氨酸羥化酶突變體，其特征在于，所述突變位點(diǎn)選自s85a、s85g、s85n、s85r、s85e、s85q、s85d、d122a、h125a、h125s、h125t、v126a、v126n、v126t、g141a、g141t、g141r、g141q、g141s、s205a和s211a中的一個(gè)或多個(gè)。

4.一種核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的脯氨酸羥化酶突變體。

5.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，包括權(quán)利要求4所述的核酸分子。

6.包含權(quán)利要求4所述的核酸分子或權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞或原核細(xì)胞。

8.一種提高羥脯氨酸產(chǎn)量和/或純度的方法，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求6或7所述的宿主細(xì)胞發(fā)酵獲得。

9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的脯氨酸羥化酶突變體或權(quán)利要求4所述的核酸分子或權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在制備羥脯氨酸中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的脯氨酸羥化酶突變體或權(quán)利要求4所述的核酸分子或權(quán)利要求6-7任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞在制備化妝品或藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及脯氨酸羥化酶突變體及其在羥脯氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用和方法。本發(fā)明提供p4h<supgt;G141A</supgt;、p4h<supgt;S85A</supgt;、p4h<supgt;V126A</supgt;、p4h<supgt;H125A</supgt;、p4h<supgt;S205A</supgt;、p4h<supgt;D122A</supgt;、p4h<supgt;S211A</supgt;等位點(diǎn)的突變，這些突變酶的表達(dá)能顯著增加羥脯氨酸的產(chǎn)量，降低脯氨酸的比例，后將這些位點(diǎn)分別進(jìn)行飽和突變，并將優(yōu)勢(shì)突變進(jìn)行組合能獲得性能更好的菌株，如p4h<supgt;S85Q?V126A</supgt;、p4h<supgt;S85A?V126T</supgt;、p4h<supgt;G141A?H125S</supgt;、p4h<supgt;G141A?H125T</supgt;。較傳統(tǒng)化學(xué)法相比，本工藝生產(chǎn)成本低、綠色環(huán)保、可進(jìn)行大規(guī)模連續(xù)性生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：朱文娟,徐曉麗,萬(wàn)麗花,江君君,薛金丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘇州華賽生物工程技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/28