本發明屬于基因工程，具體涉及提高重組蛋白表達水平的方法、基因工程細胞、試劑盒、表達系統。

背景技術：

1、近年來，醫藥市場對重組蛋白藥物的需求不斷增長，其中重組抗體藥物保留天然抗體特異性和生物活性的同時，消除了抗體的免疫原性，已經運用于多種疾病的診斷和治療。由于哺乳動物細胞自身具備蛋白折疊和翻譯后修飾的功能，表達蛋白性質與天然蛋白接近，已經成為目前重組蛋白藥物生產的重要平臺。中國倉鼠卵巢(chinese?hamsterovary,cho)細胞具有與人類細胞相似的翻譯后修飾系統，且易于懸浮馴化，可以實現無血清無蛋白培養，已經成為目前生物制藥研發和生產的主要平臺。利用cho細胞成功生產了眾多細胞因子、重組酶、重組抗體、重組融合蛋白等有價值的生物技術藥物，為市場需求作出重大貢獻。目前，通過表達載體優化、細胞系改造和培養工藝改進等方法在一定程度上提高了重組抗體的表達水平，但利用cho細胞生產重組抗體藥物的產量及活性仍無法完全滿足市場需求。

2、微小rna(microrna,mirna)是一種來源于內源性染色體上的非編碼單鏈rna，可以調控細胞增殖、分化、免疫調節、代謝等生物學過程。由于這些內源性的小rna可以調控所有的細胞通路，mirna被廣泛應用于cho細胞工程中以提高目的蛋白的表達。單個mirna在不增加細胞翻譯負擔的前提下，可結合多個靶基因從而調節不同的代謝途徑，并且當調節不同的有益于抗體產生的代謝通路時，可能會產生疊加效應。隨著高通量組學技術的不斷發展，cho細胞多組學分析為細胞系改造和生產力提高提供了新策略，mirna可作為細胞工程的潛在靶點。目前雖已有一些研究提示一些mirna靶點影響cho細胞系重組蛋白的表達性能，但是整體上能夠實現產業化應用的策略相對有限，因此需要對mirna靶點開展持續的創新研究，為重組蛋白表達性能、產量等的提升提供新的策略。

技術實現思路

1、為了克服現有技術的缺陷，本發明的目的之一在于提供提高重組蛋白表達水平的方法，mir-21-5p為基因工程靶點，或者聯合mir-92a-3p作為基因工程靶點，通過提高mir-21-5p表達，或者提高提高mir-21-5p表達同時抑制mir-92a-3p表達的方式，提高哺乳動物細胞重組蛋白表達水平。

2、本發明的目的之二在于提供基因工程細胞，mir-21-5p過表達，mir-92a-3p表達抑制，作為宿主細胞，能夠高效表達生產重組蛋白。

3、本發明的目的之三在于提供試劑盒，用于構建重組蛋白表達系統，以本發明提供的mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的細胞系為宿主細胞，實現重組蛋白高效生產。

4、本發明的目的之四在于提供重組蛋白表達系統，以本發明提供的mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的細胞系為宿主細胞構建而成，實現重組蛋白高效生產。

5、為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

6、提高重組蛋白表達量的方法，提高重組蛋白表達系統mir-21-5p表達量；

7、或者，提高重組蛋白表達系統mir-21-5p表達量、降低mir-92a-3p表達量。

8、在本發明的具體實施方式中，所述重組蛋白表達系統為能夠表達重組蛋白的cho細胞；

9、可選的，通過將mir-21-5p?mimics、或mir-21-5p?mimics和mir-92a-3pinhibitor聯合轉染至重組蛋白表達系統構建mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的重組蛋白表達系統。

10、在本發明的具體實施方式中，通過將mir-21-5p?mimics和mir-92a-3p?inhibitor聯合轉染至表達重組蛋白的cho細胞構建mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的表達重組蛋白的cho細胞。

11、可選的，mir-21-5p?mimics的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；mir-92a-3pinhibitor核苷酸序列如seq?id?no.2所示。。

12、在本發明的具體實施方式中，所述mir-21-5p?mimics、或mir-21-5p?mimics和mir-92a-3p?inhibitor的轉染終濃度為30nm。

13、可選的，所述mir-21-5p?mimics和mir-92a-3p?inhibitor的轉染用量比例為1：1。

14、基因工程細胞，所述細胞作為重組蛋白表達用宿主細胞，其mir-21-5p過表達；或mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制。可選的，所述細胞為cho細胞。

15、試劑盒，其特征在于，包括上述基因工程細胞、含有目的蛋白編碼基因的重組蛋白表達載體、轉染試劑；

16、或者包括cho細胞、mir-21-5p?mimics、mir-92a-3p?inhibitor、重組蛋白表達載體，轉染試劑。

17、表達系統，采用上述試劑盒構建而成。

18、在本發明的具體實施方式中，所述重組蛋白為阿達木抗體。本領域技術人員應當可以理解的是，本發明方案可以應用于其他重組蛋白表達，不僅限于阿達木抗體。

19、上述重組蛋白表達系統可用于制備包含目的蛋白的制劑；所述制劑選自蛋白檢測試劑、治療或預防疾病的目的蛋白藥物、帶有目的蛋白的基因藥物。

20、本發明的有益效果：

21、本發明以提高重組蛋白產能提供新的策略為核心發明目的，篩選驗證mir-21-5p可以作為哺乳動物細胞(具體為cho細胞)的基因工程改造靶點，通過構建mir-21-5p過表達細胞作為重組蛋白表達用宿主細胞，構建重組蛋白穩定表達系統，提高重組蛋白表達量，在本發明的具體實施方式驗證能夠應用于提高重組阿達木抗體穩定表達量；

22、進一步的，本發明創造性的將mir-21-5p和mir-92a-3p聯合作為哺乳動物細胞(具體為cho細胞)的基因工程改造靶點，通過構建mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的細胞作為重組蛋白表達用宿主細胞，構建重組蛋白穩定表達系統，相比單靶點構建的表達系統，能夠更進一步提高重組蛋白表達量。

技術特征：

1.提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，提高重組蛋白表達系統mir-21-5p表達量；

2.如權利要求1所述的提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，所述重組蛋白表達系統為能夠表達重組蛋白的cho細胞。

3.如權利要求2所述的提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，通過將mir-21-5pmimics、或mir-21-5p?mimics和mir-92a-3p?inhibitor聯合轉染至重組蛋白表達系統構建mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制的重組蛋白表達系統。

4.如權利要求3所述的提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，mir-21-5p?mimics的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；mir-92a-3p?inhibitor核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5.如權利要求4所述的提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，所述mir-21-5pmimics、或mir-21-5p?mimics和mir-92a-3p?inhibitor的轉染終濃度為30nm。

6.如權利要求5所述的提高重組蛋白表達量的方法，其特征在于，所述mir-21-5pmimics和mir-92a-3p?inhibitor的轉染用量比例為1：1。

7.基因工程細胞，其特征在于，所述細胞作為重組蛋白表達用宿主細胞，其mir-21-5p過表達；或mir-21-5p過表達、mir-92a-3p表達抑制。

8.如權利要求7所述的基因工程細胞，其特征在于，所述細胞為cho細胞。

9.試劑盒，其特征在于，包括如權利要求7或8所述的基因工程細胞、含有目的蛋白編碼基因的重組蛋白表達載體、轉染試劑；

10.表達系統，其特征在于，采用如權利要求9所述試劑盒構建而成。

技術總結
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及提高重組蛋白表達水平的方法、基因工程細胞、試劑盒、表達系統。本發明篩選驗證miR?21?5p可以作為哺乳動物細胞（具體為CHO細胞）的基因工程改造靶點，構建miR?21?5p過表達的重組蛋白穩定表達系統，可以提高重組蛋白表達量；進一步的，本發明創造性的將miR?21?5p和miR?92a?3p聯合作為基因工程改造靶點，通過構建miR?21?5p過表達、miR?92a?3p表達抑制的重組蛋白穩定表達系統，相比單靶點構建的表達系統，能夠更進一步提高重組蛋白表達量。

技術研發人員：張璽,王天云,朱靜湲,郭子函,王小引,賈巖龍,王穩,牛帥晨,劉雅靜,楊雅欣,范子揚
受保護的技術使用者：新鄉醫學院
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24