本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑及其制備方法和應(yīng)用，所述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑是一種苯并咪唑類衍生物。

背景技術(shù)：

1、rna除了編碼和組裝蛋白質(zhì)外，還參與了無(wú)數(shù)的細(xì)胞活動(dòng)。人類的基因組中只有1-2％編碼蛋白質(zhì)，但其中約80％被轉(zhuǎn)錄成rna。雖然大多數(shù)轉(zhuǎn)錄的rna是非編碼的，但許多非編碼rna在功能上參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)和疾病狀態(tài)。這些功能性的非編碼rna是相關(guān)疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

2、目前，靶向rna的方法是使用優(yōu)先靶向非結(jié)構(gòu)化區(qū)域的寡核苷酸化合物，因此，靶向rna的治療方法的開發(fā)主要集中在使用寡核苷酸。然而，rna結(jié)構(gòu)已被證明在重要的生物過程和疾病狀態(tài)中起著關(guān)鍵作用。由于rna生物學(xué)通常是由其形成的結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的，因此，靶向結(jié)構(gòu)化rna可能是解決相關(guān)問題的潛在策略。然而，人們對(duì)結(jié)構(gòu)化rna和小分子化合物之間的相互作用知之甚少，這也導(dǎo)致了人們認(rèn)為用小分子化合物靶向結(jié)構(gòu)化rna是不可行的。然而，近年來，已有大量研究表明小分子已經(jīng)被研究用于靶向核糖體的三維結(jié)構(gòu)、核糖體開關(guān)、某些病毒rna和核苷酸的重復(fù)擴(kuò)增，小分子完全具備靶向rna的能力。

3、在疾病生物學(xué)中起作用的一類結(jié)構(gòu)化rnas是非編碼micrornas(mirs)。它們是由高度結(jié)構(gòu)化的前體產(chǎn)生的。pre-mir-21的前體(pri-mir-21)由drosha在細(xì)胞核中逐步加工為pre-mir-21，隨后pre-mir-21由dicer在細(xì)胞質(zhì)中加工，產(chǎn)生成熟的mir-21，成熟的mir-21被加載到rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)中以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。許多mirs在人類疾病生物學(xué)中發(fā)揮重要作用。例如，已有研究表明mir-21的表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)，并且在實(shí)體腫瘤中表達(dá)。

4、通過對(duì)mirna等轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)控實(shí)現(xiàn)腫瘤、漸凍癥、奧爾波特綜合征(as)等重大疾病的治療是現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外生物醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)前沿。目前，下調(diào)mirna表達(dá)水平的方法，主要包括化學(xué)合成寡核苷酸(aso)和構(gòu)建載體這兩種方法。化學(xué)合成寡核苷酸是采用反義mirna來阻斷特定mirna的活性。對(duì)于載體而言，主要是構(gòu)建質(zhì)粒或者病毒系統(tǒng)來表達(dá)與mirna前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的sirna。但這些方法因?yàn)閮r(jià)格較昂貴，目前大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，還無(wú)法真正用于臨床治療。因此，開發(fā)新型的手段來下調(diào)mirna水平，成為極為迫切的研究領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的下調(diào)mir-21的方法價(jià)格昂貴且未真正應(yīng)用于臨床的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑；該轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑在體內(nèi)外能夠結(jié)合pre-mir-21并抑制其轉(zhuǎn)錄后加工的剪切，從而沉默、修飾和/或改善mir-21的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)抑制人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231的生長(zhǎng)；所述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑穩(wěn)定性好，便于儲(chǔ)存，成本低廉，抗腫瘤效果好。

2、本發(fā)明另一目的在于提供一種上述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑的制備方法。

3、本發(fā)明再一目的在于提供上述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的又一目的在于提供一種含有上述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑的抗腫瘤藥物。

5、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

6、一種pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑，所述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑為具有如下式ⅰ所示結(jié)構(gòu)的苯并咪唑類衍生物：

7、

8、r1為胺類取代基；r2為氫或其中r為氫、烷基、取代烷基、芳基或取代芳基；r3為甲基；r4、r5、r6、r7分別為氟、氯、溴、烷基、氫、氨基、硝基、甲氧基、三氟甲基或胺類取代基；r8為氫、烷基、取代烷基、芳基或取代芳基。

9、優(yōu)選的，r2為氫或其中r為氫、烷基、取代烷基；r4、r5、r6、r7分別為烷基、氫、氨基、硝基、甲氧基、三氟甲基或胺類取代基；r8為氫、烷基或取代烷基。

10、更加優(yōu)選的，r2為氫或其中r為氫、烷基；r4、r5、r6、r7分別為烷基、氫、甲氧基、三氟甲基或胺類取代基；r8為氫或烷基。

11、進(jìn)一步優(yōu)選的，r2為氫；r4、r5、r6、r7為烷基、氫或胺類取代基；r8為氫。

12、所述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑更加優(yōu)選為具有以下式ⅱ所示結(jié)構(gòu)的化合物，命名為n2-(1h-苯并[d]咪唑-2-基)-n4(3-(二甲氨基)丙基)-6-甲基嘧啶-2,4-二胺；

13、

14、上述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑的制備方法按照以下操作步驟：

15、(1)以取代的鄰苯二胺為起始原料，在堿性條件下與各種胺類取代基發(fā)生親核取代反應(yīng)得到中間體1；

16、(2)中間體1與二氰二胺在酸性條件下回流反應(yīng)得到中間體2；

17、(3)中間體2在堿性條件下與取代的乙酰乙酸乙酯發(fā)生成環(huán)反應(yīng)得到中間體3；

18、(4)中間體3在堿性條件下與胺發(fā)生縮合反應(yīng)得到終產(chǎn)物pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑。

19、所述取代的鄰苯二胺的結(jié)構(gòu)如式ⅲ所示，所述中間體1的結(jié)構(gòu)如式ⅳ所示，所述中間體2的結(jié)構(gòu)如式ⅴ所示，所述中間體3的結(jié)構(gòu)如式ⅵ所示：

20、

21、其中，r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8如前述所定義。

22、制備pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑的反應(yīng)方程式如下：

23、

24、其中，r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8如前述所定義。

25、所述步驟(1)中，反應(yīng)溫度為25℃～160℃，優(yōu)選25℃～40℃；反應(yīng)時(shí)間為8h-24h，優(yōu)選10h-14h；反應(yīng)使用的溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、叔丁醇或異丙醇，優(yōu)選n,n-二甲基甲酰胺；堿性條件使用的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫、醋酸鉀、三乙胺、二乙胺、n,n-二異丙基乙胺、吡啶或氫氧化鉀，優(yōu)選碳酸鉀；

26、所述步驟(2)中，反應(yīng)溫度為90℃～160℃，優(yōu)選100℃～120℃；反應(yīng)時(shí)間為1h-6h，優(yōu)選1h-2h；酸性條件使用的酸為質(zhì)量濃度為10％硫酸或物質(zhì)的量的濃度為3m的鹽酸水溶液，優(yōu)選質(zhì)量濃度為10％硫酸；

27、所述步驟(3)中，反應(yīng)溫度為100℃～180℃，優(yōu)選120℃～140℃；反應(yīng)時(shí)間為16h-72h，優(yōu)選24h-48h；堿性條件使用的堿為碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸銫、醋酸鉀、三乙胺、二乙胺、n,n-二異丙基乙胺、吡啶或氫氧化鉀，優(yōu)選為n,n-二異丙基乙胺；反應(yīng)使用的溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、叔丁醇或異丙醇，優(yōu)選為n,n-二甲基甲酰胺；

28、所述步驟(4)中，反應(yīng)溫度為25℃～160℃，優(yōu)選25℃～40℃；反應(yīng)時(shí)間為6h-24h，優(yōu)選8h-16h；縮合反應(yīng)使用的縮合劑為o-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽、6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯、((1h-苯并[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸鹽(v)或(3h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽，優(yōu)選(3h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸鹽；堿性條件使用的堿為吡啶、三乙胺或1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯，優(yōu)選1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯；反應(yīng)使用的溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、n,n-二甲基乙酰胺、甲醇、乙醇、叔丁醇或異丙醇，優(yōu)選n,n-二甲基甲酰胺。

29、上述的pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述抗腫瘤藥物為抗三陰性乳腺癌的藥物。

30、一種包含了上述pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑的抗腫瘤藥物。

31、所述抗腫瘤藥物可以制成片劑、膠囊、注射劑等制劑。

32、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

33、(1)本發(fā)明著眼于與mir-21的表達(dá)水平相關(guān)的三陰性乳腺癌，獲得通式ⅰ所示結(jié)構(gòu)的化合物，所得化合物均未見文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)構(gòu)上具備新穎性。

34、(2)目前現(xiàn)有技術(shù)中幾乎沒有其他pre-mir-21小分子抑制劑，而本發(fā)明所涉及的化合物對(duì)于pre-mirna?21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切具有較強(qiáng)的抑制作用，可以用以治療由mir-21過表達(dá)所引起的腫瘤或與mir-21表達(dá)異常相關(guān)的其它疾病；具體而言，該pre-mir-21轉(zhuǎn)錄后加工的剪切抑制劑在體內(nèi)外能夠結(jié)合pre-mir-21并抑制其轉(zhuǎn)錄后加工的剪切，沉默、修飾和/或改善mir-21的表達(dá)，最終實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)抑制人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231的生長(zhǎng)。

35、(3)本發(fā)明所涉及的化合物穩(wěn)定性好，便于儲(chǔ)存，成本低廉，抗腫瘤效果較好；本發(fā)明所述苯并咪唑衍生物結(jié)構(gòu)新穎，豐富了苯并咪唑衍生物在制備抗癌藥物領(lǐng)域的研究。