本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種廣譜中和呼吸道合胞病毒的納米抗體研發(fā)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、呼吸道合胞病毒（respiratory?syncytial?virus，rsv）是全球嬰幼兒急性下呼吸道感染的重要病原體，可導(dǎo)致支氣管炎和肺炎等病癥，甚至死亡，對(duì)公共衛(wèi)生造成巨大威脅。全球超過(guò)95%的2歲以下兒童都感染過(guò)rsv，并且由rsv感染引起的細(xì)支氣管炎是導(dǎo)致2歲以下兒童住院的主要原因之一，也是導(dǎo)致嬰兒死亡率上升的重要因素。此外，rsv病毒在老年人群中引起的住院和死亡率與流感相當(dāng)。盡管危害嚴(yán)重，但這場(chǎng)特殊的病毒感染，目前在全球范圍的安全有效rsv疫苗極少，同時(shí)缺乏特異性的抗rsv治療性藥物。因此，我們迫切需要開(kāi)發(fā)出一款安全、高效、廣譜和經(jīng)濟(jì)有效的新一代rsv中和抗體。

2、rsv是一種包膜負(fù)鏈rna病毒，屬于副黏病毒科肺病毒屬。rsv基因組全長(zhǎng)15.2?kb，含有10個(gè)基因，編碼11個(gè)蛋白。其中g(shù)和f蛋白是病毒表面上兩種主要的糖蛋白，在介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要的角色。g蛋白主要是作為吸附蛋白發(fā)揮功能，通過(guò)與宿主細(xì)胞表面的一個(gè)或多個(gè)分子相互作用促使病毒顆粒與靶細(xì)胞結(jié)合，但不是病毒感染所必需的。f蛋白的主要功能是介導(dǎo)病毒包膜和細(xì)胞膜的融合，并且是唯一負(fù)責(zé)膜融合的蛋白，這是病毒通過(guò)形成合胞體進(jìn)入和傳播所必需的。此外，f蛋白和g蛋白是重要的抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，是中和抗體的主要靶標(biāo)，也是疫苗設(shè)計(jì)和小分子抑制劑的重要靶點(diǎn)。根據(jù)g蛋白的不同將rsv毒株分成兩種不同的亞型（rsv?a和rsv?b），兩種亞型g蛋白氨基酸的同源性只有50%；f蛋白相對(duì)保守，序列只有10%的差異，因此，f蛋白被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)疫苗和藥物的最理想目標(biāo)。

3、開(kāi)發(fā)安全經(jīng)濟(jì)有效的呼吸道合胞病毒（rsv）疫苗和抗體類藥物，一直是世界衛(wèi)生組織（world?health?organization，who）的優(yōu)先事項(xiàng)。自20世紀(jì)60年代以來(lái)，眾多科學(xué)家一直在研發(fā)rsv預(yù)防及治療藥物。然而，迄今為止已獲批上市的rsv抗體尚顯不足。目前已經(jīng)上市的兩種預(yù)防rsv抗體為帕利珠單抗（palivizumab）和樂(lè)唯初?（nirsevimab/尼塞韋單抗），但它們都是預(yù)防性使用的，其中palivizumab僅限于高危嬰兒，且整個(gè)rsv季節(jié)需要給藥的成本使得它已不適用于所有嬰兒。而nirsevimab是一種全人源單克隆抗體，由單克隆抗體d25優(yōu)化改造而來(lái)，識(shí)別pre-f蛋白構(gòu)象表位?，對(duì)a和b兩個(gè)亞型都有很強(qiáng)的中和作用，其在臨床分離株的中和活性比palvizumab提高50倍左右。對(duì)抗體可結(jié)晶片段（fc）進(jìn)行優(yōu)化后形成一種單劑次長(zhǎng)效抗體，適用于即將進(jìn)入或出生在第一個(gè)rsv感染季的新生兒和嬰兒，預(yù)計(jì)將于2024-2025年rsv感染季在中國(guó)使用。

4、1993年，比利時(shí)科學(xué)家在《nature》雜志上首次報(bào)道納米抗體，該抗體來(lái)源于駱駝科動(dòng)物重鏈抗體可變區(qū)(variable?domain?of?heavy?chain?antibody，vhh)，vhh保留了完整的抗原結(jié)合能力，分子量?jī)H為15?kda，是傳統(tǒng)抗體的1/10，也稱為納米抗體。和傳統(tǒng)抗體相比，納米抗體具有眾多優(yōu)點(diǎn)：1）納米抗體的分子量約是傳統(tǒng)抗體的十分之一，使得納米抗體更容易滲透到組織；2）納米抗體特異性好、親和力強(qiáng)；3）納米抗體易于改造成多特異性或者多價(jià)抗體；4）納米抗體穩(wěn)定性和溶解性好，理化性質(zhì)穩(wěn)定；5）納米抗體能夠在原核系統(tǒng)中高表達(dá)，生產(chǎn)成本更低；6）由于羊駝源納米抗體和人的vh3家族序列具有高度同源性，免疫原性低。綜上所述，納米抗體在基礎(chǔ)生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的研究潛力和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于上述研究背景，急需解決傳統(tǒng)rsv廣譜中和抗體存在的不足，本發(fā)明旨在開(kāi)發(fā)安全、廣譜和經(jīng)濟(jì)有效的納米抗體，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)單克隆抗體，提高臨床治療水平。

2、本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題，進(jìn)行了科學(xué)研究，獲得了一種靶向呼吸道合胞病毒f蛋白的中和納米抗體，該抗體具有seq?id?no:1的氨基酸序列和seq?id?no:2的對(duì)應(yīng)核苷酸序列。該納米抗體與呼吸道合胞病毒f蛋白有高的結(jié)合活性及特異性。本發(fā)明提供的納米抗體具有高親和力、高中和性的特征，可以有效中和rsv?a2和b毒株，中和能力優(yōu)于上市抗體nirsevimab。因此，該納米抗體具有作為候選預(yù)防和治療rsv藥物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的巨大潛力，同時(shí)也為其他針對(duì)rsv的抗病毒治療法的發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)。

3、具體地，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面：

4、一方面，本發(fā)明涉及一種納米抗體，其包含如seq?id?no:3所示的cdr1，如seq?idno:4所示的cdr2，和如seq?id?no:5所示的cdr3。

5、其中，上述納米抗體的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

6、其中，上述納米抗體特異性結(jié)合rsv?f糖蛋白。

7、另一方面，本發(fā)明還涉及多核苷酸，其編碼上述的納米抗體。

8、所述多核苷酸的如seq?id?no:2所示。

9、另一方面，本發(fā)明還涉及表達(dá)載體，其包含上述的多核苷酸。

10、另一方面，本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，其包含上述的表達(dá)載體。

11、另一方面，本發(fā)明還涉及上述的納米抗體、多核苷酸或表達(dá)載體在制備用于預(yù)防或治療受試者中與rsv感染相關(guān)的疾病的藥物或試劑盒中的應(yīng)用。

12、其中，所述受試者為哺乳動(dòng)物，優(yōu)選為人；上述藥物或試劑盒包含選自上述的納米抗體、上述的多核苷酸和上述的表達(dá)載體中的任意一項(xiàng)或多項(xiàng)。

13、其中，所述疾病包括上呼吸道疾病或下呼吸道感染，優(yōu)選地，所述下呼吸道感染包括肺炎，細(xì)支氣管炎，長(zhǎng)期復(fù)發(fā)性喘息和哮喘。

14、另一方面，本發(fā)明還涉及上述納米抗體的制備方法，其包括以下工序：

15、（1）用0.5?mg/次的rsv?pre-f?(ds?cav1和ds2)蛋白對(duì)駱駝進(jìn)行4次免疫，其中rsvpre-f?(ds?cav1和ds2)蛋白氨基酸序列如seq?id?no:6和seq?id?no:7所示；

16、（2）靜脈取血并分離其中pbmc，并通過(guò)pcr擴(kuò)增出vhh片段，其中pcr所用引物如seqid?no:8、seq?id?no:9所示；

17、（3）將擴(kuò)增出的vhh克隆到噬菌粒中，形成重組質(zhì)粒；

18、（4）通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌tg1感受態(tài)中，構(gòu)建vhh的噬菌體文庫(kù)，其中，根據(jù)需要可進(jìn)一步增加在-80℃下冷凍噬菌體文庫(kù)菌的步驟；

19、（5）通過(guò)噬菌體展示技術(shù)將vhh片段的表達(dá)到噬菌體表面的外殼蛋白上，并加入km13輔助噬菌體擴(kuò)增含有vhh的噬菌體；

20、（6）進(jìn)行2輪生物淘選對(duì)所述文庫(kù)中的納米抗體進(jìn)行篩選；

21、（7）獲得ds2結(jié)合活性高的納米抗體。

22、更具體地，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面的研究?jī)?nèi)容：

23、研究?jī)?nèi)容一：構(gòu)建噬菌體展示納米抗體文庫(kù)、進(jìn)行單克隆陽(yáng)性噬菌體的篩選、序列比對(duì)及納米抗體的表達(dá)與純化；

24、（1）噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建。目前，篩選納米抗體的常用技術(shù)為噬菌體展示技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，rsv?f蛋白被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)疫苗和藥物的最理想目標(biāo)。因此，為了構(gòu)建針對(duì)rsv?f蛋白的納米抗體文庫(kù)，我們將純度較高的抗原蛋白ds?cav1和ds2免疫駱駝（這兩種抗原蛋白是rsv?pre?f經(jīng)工程化改造后獲得的穩(wěn)定形式）。我們從完成免疫的駱駝外周血中獲得重鏈抗體的可變區(qū)序列（vhh），構(gòu)建噬菌體展示納米抗體文庫(kù)。

25、（2）單克隆陽(yáng)性噬菌體的篩選與序列比對(duì)。我們利用抗原蛋白ds2對(duì)以上構(gòu)建的文庫(kù)進(jìn)行了2輪淘選。從兩輪淘選的計(jì)數(shù)板上挑取單克隆，制備為單克隆噬菌體后，通過(guò)phage-elisa結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及基因測(cè)序，獲得陽(yáng)性單克隆vhh的序列信息。

26、（3）vhh序列比對(duì)及納米抗體的表達(dá)與純化。vhh包含fr區(qū)（保守框架區(qū)）和cdr區(qū)（互補(bǔ)決定區(qū)）。fr區(qū)序列相對(duì)保守，而不同抗體間的差異主要位于cdr區(qū)。經(jīng)序列比對(duì)排除重復(fù)的克隆序列后，獲得候選納米抗體，并將其序列克隆至ptt5載體中，并通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞hek?293f表達(dá)與純化。

27、研究?jī)?nèi)容二：納米抗體結(jié)合活性和中和活性的檢測(cè)；

28、（1）納米抗體結(jié)合活性（ec50）檢測(cè)。通過(guò)間接?elisa評(píng)價(jià)納米抗體（2a5）結(jié)合活性。設(shè)計(jì)3種不同抗原的結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分別是pre-f（ds-cav1）（序列請(qǐng)參考文獻(xiàn)：mclellan,?jasons?et?al.?“structure-based?design?of?a?fusion?glycoprotein?vaccine?forrespiratory?syncytial?virus.”?science?(new?york,?n.y.)?vol.?342,6158?(2013):592-8.）;?pre-f（ds2）(序列請(qǐng)參考文獻(xiàn)：joyce?mg,?zhang?b,?ou?l,?et?al.?iterativestructure-based?improvement?of?a?fusion-glycoprotein?vaccine?against?rsv.?natstruct?mol?biol.?2016;23(9):811-820.)?;?post-f（序列請(qǐng)參考文獻(xiàn)：mclellan,?jasons?et?al.?“structure?of?respiratory?syncytial?virus?fusion?glycoprotein?in?thepostfusion?conformation?reveals?preservation?of?neutralizing?epitopes.”journal?of?virology?vol.?85,15?(2011):?7788-96），其中nirsevimab（武漢普健生物科技有限公司，dvv02802）（僅識(shí)別融合前狀態(tài)，即，僅識(shí)別pre-f）作為陽(yáng)性對(duì)照中和抗體。進(jìn)一步探究rsv中和納米抗體結(jié)合不同亞型f蛋白的能力以及是否對(duì)pre-f蛋白和post-f蛋白具有偏向性。

29、（2）納米抗體中和活性（ic50）檢測(cè)。基于rsv中和免疫熒光實(shí)驗(yàn)方法，我們計(jì)劃通過(guò)免疫熒光和高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，計(jì)算出候選納米抗體中和活性ic50值，評(píng)價(jià)候選納米抗體的中和病毒的能力，為后續(xù)納米抗體的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

30、研究?jī)?nèi)容三：評(píng)價(jià)納米抗體在rsv小鼠感染模型中的預(yù)防和治療效果。

31、小鼠在經(jīng)滴鼻途徑感染rsv?的前/后一天，通過(guò)腹腔注射候選納米抗體，小鼠感染4天后，分離血清，檢測(cè)血清中納米抗體濃度；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)小鼠肺組織和鼻甲骨的病毒rna拷貝數(shù)；通過(guò)免疫熒光測(cè)定肺組織和鼻甲骨的病毒滴度。

32、本研究所篩選到的納米抗體2a5，其氨基酸序列及編碼其的核苷酸序列分別如seqid?no:1、2所示，其特異性靶向呼吸道合胞病毒表面的融合f糖蛋白，具有優(yōu)異的中和效果，能夠發(fā)揮有效的預(yù)防和治療作用，具有明顯的臨床藥物研發(fā)潛力。

33、術(shù)語(yǔ)“pre-f?ds-cav1”是指rsv病毒表面融合f糖蛋白的預(yù)融合穩(wěn)定形式。rsv?f由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)，在感染細(xì)胞前會(huì)處于相對(duì)不穩(wěn)定的pre形式，但經(jīng)過(guò)蛋白工程化改造，在f蛋白的c末端引入兩個(gè)突變(s155c和s290c)使其之間形成二硫鍵以增加蛋白的穩(wěn)定性；此外，還在構(gòu)象兩個(gè)凹槽部位進(jìn)行了修飾(s190f和v207l)，使其得到填充，獲得較穩(wěn)定的pre-f并將其命名為ds-cav1。其中，ds-cav1的氨基酸序列如seq?id?no:6所示。

34、術(shù)語(yǔ)“pre-f?ds2”?是在ds-cav1的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，通過(guò)基因連接，融合肽的刪除，并且通過(guò)額外的二硫鍵穩(wěn)定了原體間的運(yùn)動(dòng)。被稱為第二代“ds2”。?ds2?免疫原更優(yōu)，不需要弗林蛋白酶裂解以及增強(qiáng)的抗熱失活抗原穩(wěn)定性。其中，ds2的氨基酸序列如seq?idno:7所示。

35、術(shù)語(yǔ)“rsv?post-f蛋白”是指rsv病毒表面融合f糖蛋白在感染細(xì)胞后會(huì)由于二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，形成穩(wěn)定性更強(qiáng)的post-f亞型，其氨基酸序列如seq?id?no:8所示。

36、在上述rsv?f的兩個(gè)亞型中，由于在rsv病毒侵染宿主細(xì)胞前，pre-f蛋白呈“棒棒糖”樣形狀，構(gòu)象不穩(wěn)定。當(dāng)接近宿主時(shí)，融合肽從蛋白三聚體的中間腔彈出，七肽重復(fù)序列（hr）hrb-α螺旋與hra-α螺旋形成hr六聚體（6hb），進(jìn)行膜融合過(guò)程。亞穩(wěn)態(tài)pre-f經(jīng)歷劇烈空間構(gòu)象變化，形成“拐杖”形狀的融合后構(gòu)象post-f，連接兩層膜，允許rsv基因組進(jìn)入細(xì)胞。

37、術(shù)語(yǔ)“pbmc”是指外周單個(gè)核細(xì)胞，其包括淋巴細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞（mononuclearcell），本發(fā)明實(shí)施例中代指駱駝淋巴細(xì)胞。

38、術(shù)語(yǔ)“噬菌粒”是指含有絲狀噬菌體復(fù)制起始點(diǎn)的質(zhì)粒。

39、術(shù)語(yǔ)“噬菌體文庫(kù)”是指將特定目的基因?qū)胛⑸锊?chǔ)存在該微生物中。本發(fā)明中特指將上述噬菌粒導(dǎo)入大腸桿菌tg1感受態(tài)中，使全部含有vhh片段的基因可以長(zhǎng)時(shí)間在大腸桿菌中保存，用于后續(xù)篩選。

40、術(shù)語(yǔ)“噬菌體文庫(kù)菌”是指保存了目的基因的微生物。本發(fā)明中特指保存了全部vhh片段的基因的大腸桿菌tg1。

41、術(shù)語(yǔ)“噬菌體展示技術(shù)”是指將外源蛋白的基因序列插入到噬菌體編碼外殼蛋白的基因區(qū)域的適當(dāng)位置上，使該外源蛋白可以隨噬菌體的增殖表達(dá)在噬菌體表面的外殼蛋白上。

42、術(shù)語(yǔ)“km13輔助噬菌體”是指用于輔助噬菌粒增殖噬菌體的特殊噬菌體，其本身編碼不影響目標(biāo)噬菌體的增殖過(guò)程。

43、術(shù)語(yǔ)“中和活性”是指抗體具有阻斷病毒入侵宿主細(xì)胞的能力。中和活性的檢測(cè)一般需要使用細(xì)胞培養(yǎng)和對(duì)應(yīng)的病毒或細(xì)菌等病原體，通過(guò)觀察抗體對(duì)該種病原體感染宿主細(xì)胞的抑制情況而測(cè)定出來(lái)，即中和抗體效價(jià)。中和抗體具有結(jié)合抗體的性質(zhì)，但結(jié)合抗體不一定具有中和活性。也就是說(shuō)盡管抗體可以結(jié)合病毒表面糖蛋白，但結(jié)合的位置未必是影響病毒進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵表位。

44、術(shù)語(yǔ)“結(jié)合活性”是指抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原的能力。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，一般通過(guò)elisa法測(cè)定。

45、術(shù)語(yǔ)“ic50”是指半抑制濃度，本發(fā)明中ic50的值越低，表示抗體中和活性越高。

46、術(shù)語(yǔ)“ec50”是指半數(shù)效應(yīng)濃度，本發(fā)明中ec50的值越低，表示抗體與抗原結(jié)合活性越高。