本發明屬于基因工程，具體涉及一株具有高定殖能力的?nissle?1917重組菌株及應用。

背景技術：

1、蜜蜂腸道內的微生物群落占據著獨特的生態位，它們不僅相互作用，還與宿主蜜蜂進行復雜的互動，在蜜蜂的營養吸收、疾病防御以及學習記憶等關鍵生理過程中發揮著不可或缺的作用。腸道微生物的微妙變化不僅關乎蜜蜂個體的健康和行為，還可能對農業產出和生態系統產生廣泛而深遠的影響。因此，通過改造腸道微生物來恢復和增強蜜蜂的健康，已經成為一種有效的策略。

2、在養蜂業中，使用益生菌來治療或預防蜂箱中的微生物感染是很常見的。大多數商業上可獲得的蜜蜂益生菌由非土著微生物組成，主要以 lactobacillus屬和 bifidobacterium屬的人類益生菌為主。然而這類益生菌很難在蜜蜂腸道中穩定定殖，即便通過持續飼喂，它們在蜜蜂腸道菌群中的比例通常也低于1%，并會在停止飼喂后迅速消亡。另一種方法是分離蜜蜂的原生腸道微生物，如從工蜂中分離腸道勻漿，飼喂微生物群缺乏或微生物群受到干擾的不健康蜜蜂。然而，在腸道微生物分離過程中可能混入有害的病原體，同時，這些腸道原生菌普遍難以進行遺傳操作，在擴展腸道菌功能，如增強對特定疾病的防御能力或建立降解有害化合物的能力等方面存在明顯的局限。因此，探索工程化蜜蜂腸道菌的構建方法及其在提升蜜蜂健康中的作用，已經成為一個迫切需要深入研究的領域，有潛力為蜜蜂疾病的預防和治療帶來創新策略。將具有豐富遺傳操作工具的異源菌改造為可定殖于蜜蜂腸道的工程菌，是實現這一目標的可能思路。

3、大腸桿菌nissle?1917作為一種傳統益生菌，在預防和治療胃腸道功能障礙和免疫性疾病方面顯示出巨大潛力。nissle?1917具有固有的抗菌和抗炎特性，已被廣泛用于治療腹瀉、炎癥性腸病（ibds）以及與積累有毒代謝物相關的疾病，它不僅在人類醫學領域有著廣泛的應用，而且在包括豬、嚙齒動物、禽類、魚類等多種動物的腸道環境中展現出了廣泛的適應性。在當前的科學研究中，尚未有報道將nissle?1917益生菌應用于蜜蜂領域，作為蜜蜂的非原生腸道菌，nissle?1917同樣面臨難于在蜜蜂中定殖的問題。

4、本發明通過創新性的改造，成功將nissle?1917益生菌改造為了可在蜜蜂腸道中穩定定殖的底盤菌株。這一改造不僅賦予了nissle?1917益生菌在蜜蜂腸道中抑制外源性致病菌生長的能力，還通過其益生功能，為蜜蜂的健康提供了新的保護機制。本發明進一步擴展到了生物合成領域，通過在nissle?1917中表達番茄紅素的生產途徑，能夠有效緩解蜜蜂腸道炎癥疾病的癥狀。

5、本發明不僅在蜜蜂健康領域具有重要意義，也為合成生物學在非傳統宿主中的應用開辟了新的可能性。將工程化的nissle?1917作為底盤菌株，可用于裝載其他功能元件以拓展該菌株在蜜蜂疾病診療中的應用，也可助力探索關于腸道微生物與宿主健康相互作用的機制，同時也為開發新型生物技術產品提供了新的思路。

技術實現思路

1、本發明通過基因組精簡的方式，對野生型的nissle?1917進行基因編輯，敲除基因組上的一段長非必需片段，構建出一株高定殖能力的工程菌，可以實現在蜜蜂動物模型腸道中高效定殖的目的。同時，該工程菌株的制備較為簡單，改造后不影響菌株的活性，具有良好的基因組穩定性。并且對于所述工程菌株，可以高效的進行功能模塊的引入，也為應用工程化菌株對模式動物的腸道疾病治療和研究提供新的技術型手段。

2、本發明實現上述目的采用的技術路線如下：

3、本發明提供的技術方案之一，是一種提高大腸桿菌nissle?1917定殖能力的方法，所述方法是通過敲除nissle?1917基因組上的 xtha和 ynje基因及 xtha和 ynje基因之間的片段實現的；

4、進一步地，上述敲除的片段位于nissle?1917基因組上第309420-317765位，所述基因組的?ncbi?refseq為：nz_cp022686；敲除片段包含8346個堿基對，涉及9個基因： xtha、 ydjx、ydjy、ydjz、ynja、ynjb、ynjc、ynjd、ynje；

5、進一步地，所述大腸桿菌nissle?1917菌株來源自german?collection?ofmicroorganisms?and?cell?cultures，id號為dms6601。

6、本發明提供的技術方案之二，是一株大腸桿菌重組菌株，所述重組菌株是通過敲除大腸桿菌nissle?1917基因組上 xtha和 ynje基因及 xtha和 ynje基因之間的片段實現的；所述大腸桿菌重組菌株命名為nissle?1917-△8346；

7、進一步地，上述 xtha和 ynje基因及 xtha和 ynje基因之間的片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

8、本發明提供的技術方案之三，是重組菌nissle?1917-△8346的應用，特別是在蜜蜂腸道定殖或改善蜜蜂腸道功能中的應用。這一經過精心改造的菌株不僅能夠在蜜蜂腸道中穩固定殖，而且還能有效地抑制外來致病菌的生長，增強蜜蜂的自然防御屏障。這種能力對于維持蜜蜂腸道微生物群落的平衡至關重要，有助于預防病原體的侵襲和傳播。

9、進一步地，是在緩解蜜蜂腸道炎癥中的應用；

10、進一步地，所述重組菌nissle?1917-△8346可以作為蜜蜂腸道功能改善底盤菌，通過將各功能模塊在重組菌nissle?1917-△8346中進行表達獲得目標化合物，進而通過目標化合物在蜜蜂腸道中發揮作用，進而改善腸道功能；

11、更進一步地，所述目標化合物包括但不限于：特定的酶、藥物前體或其他有益化合物；如芳香氨基酸轉氨酶、番茄紅素等；

12、更進一步地，所述功能模塊為目標化合物的合成途徑，如通過將過表達 crte、 crtb、 crti的質粒導入nissle?1917-△8346，使得改造后的nissle?1917菌株還具備生產番茄紅素等抗氧化劑的能力，這對于緩解蜜蜂腸道炎癥具有顯著的益處。番茄紅素作為一種強大的天然抗氧化劑，能夠中和有害的自由基，減少氧化應激，保護腸道細胞不受損傷。通過在蜜蜂腸道中表達這些有益化合物，有助于減輕炎癥反應，促進腸道健康，這對于提升蜜蜂的整體福祉和生存能力至關重要。

13、有益效果：

14、與野生型的nissle?1917相比，工程菌nissle?1917-△8346的基因組改造不會影響菌株的生長，同時能夠顯著提升腸道定殖能力。在無菌蜜蜂模型中的單菌定殖中，nissle1917-△8346菌株可以有效定殖在蜜蜂腸道中10天以上；相較于野生型，nissle?1917-△8346菌株在定殖的第10天的每只蜜蜂腸道的菌落數達到約5.9×107個菌落數，具有顯著的定殖量的提升。

15、在smurf實驗測試和dss誘導的腸炎蜜蜂存活率實驗測試中，nissle?1917-△8346菌株能夠顯著緩解蜜蜂腸道的破裂，smurf陽性蜜蜂的比例只有53.3%，顯著低于未喂食工程菌的蜜蜂。另外，植入番茄紅素合成途徑的菌株能夠顯著提高腸炎蜜蜂的存活率。未喂食工程菌的蜜蜂第15天的存活率約為0，定殖菌株的蜜蜂的存活率約為40%。

16、改造后的nissle?1917菌株還可以作為一個多功能的底盤菌株，用于在蜜蜂腸道中原位表達其他有益化學品。這種靈活性為開發新的生物技術應用開辟了新的可能性，比如生產特定的酶、藥物前體或其他有益化合物。通過這種方式，nissle?1917菌株不僅能夠改善蜜蜂的健康，還可能為農業和生物制藥領域帶來創新的解決方案。