本技術涉及基因檢測，具體涉及一種檢測cyp2d6缺失型別的引物對、試劑盒及其應用。

背景技術：

1、細胞色素p450家族是藥物相代謝酶中一種重要的酶系，在生物體內的內源性物質和外源性藥物的代謝中發揮重要作用。cyp2d6基因編碼產物是細胞色素p450家族的重要成員之一。人類cyp2d6基因主要在肝臟中表達，其在肝臟酶中占比2%~9%，但是參與20%以上的臨床常用藥物的代謝，如癌癥治療藥、抗精神病藥、鎮痛藥、抗心血管疾病藥等。cyp2d6基因具有高度的多態性，從而導致藥物代謝的個體差異，進而影響藥物的療效甚至毒副作用的產生。基于cyp2d6對藥物的代謝能力，可分為超快代謝型、正常代謝型、中間代謝型和慢代謝型。其中，cyp2d6基因存在一種cyp2d6*5的突變類型，為cyp2d6全基因的缺失，該基因缺失導致藥物代謝酶失活，影響臨床用藥，該突變類型在東亞人群的發生概率為3%至7%，因此臨床用藥中需特別關注cyp2d6*5這種基因型別。現階段對cyp2d6基因缺失的檢測，常見的有以下幾種方法。

2、直接測序法，即先通過pcr反應對目標基因進行擴增，而后純化pcr產物，然后再進行一輪測序單鏈擴增，最后再對單鏈擴增產物進行純化后上機測序。雖然直接測序法為基因檢測的金標準，但是步驟繁雜，具有耗時長、成本高、開蓋易污染、靈敏度低等缺點。

3、二代測序法，通過在cyp2d6基因缺失片段區域內設定多個檢測區域設計引物同時進行擴增，再利用測序法獲取各區域的測序深度，并利用參考集及加權分析，獲得待測樣本的缺失類型。但是該方法復雜繁瑣、耗時長、成本高且對專業技術要求高。

4、多重連接探針擴增技術，包含dna變性、雜交、連接反應、pcr擴增、片段分離、數據分析步驟。該技術復雜繁瑣，涉及多儀器多技術，耗時耗力且對操作人員要求較高，不適于在臨床檢測中大范圍應用。

5、綜上，目前臨床急需要一種cyp2d6*5基因分型檢測操作簡單，檢測快速，判讀清晰準確，靈敏度高的產品。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測cyp2d6缺失型別的引物對、試劑盒及其應用。

2、具體而言，本發明提供了一種基于毛細管電泳檢測cyp2d6缺失型的試劑盒，包括pcr擴增體系和內切酶；

3、所述pcr擴增體系包括cyp2d6缺失型引物和探針。

4、在一些具體的實施方案中，所述引物為：

5、核苷酸序列如seq?id?no:?1所示的cyp2d6缺失型上游引物；

6、核苷酸序列如seq?id?no:?2所示的cyp2d6缺失型下游引物。

7、在一些實施方案中，所述內切酶選自ndei內切酶、kpni內切酶、bsobi內切酶、avai內切酶和pvuii內切酶中的一種或多種。

8、在一些具體的實施方案中，所述內切酶為ndei內切酶、kpni內切酶或bsobi內切酶。

9、在一些實施方案中，所述cyp2d6缺失型引物包含熒光標記，所述熒光標記選自fam、vic、hex、joe、rox、tamra和cy5熒光標記，所述熒光標記位于所述cyp2d6缺失型上游引物的5’端。

10、在一些實施方案中，所述pcr擴增體系還包括dna聚合酶、dntp、mgcl2、增強劑、去離子甲酰胺、熒光內標染料tk500中的一種或多種。

11、在一些具體的實施方案中，所述dna聚合酶為pfu?dna聚合酶。

12、在一些具體的實施方案中，所述增強劑為氯化四甲基銨和bsa。

13、在一些具體的實施方案中，所述pcr擴增體系包括ph8.8的20mm?tris-hcl，20mmkcl，10mm?(nh4)2so4，2mm?mgcl2，200μm?dntps，50mm?氯化四甲基銨，300μg/mlbsa和0.1u/μl?pfu?dna聚合酶。

14、在一些具體的實施方案中，所述試劑盒還包括核酸提取試劑、cyp2d6缺失型陰性質控品和cyp2d6缺失型陽性質控品中的一種或多種。

15、本發明還提供了一種檢測cyp2d6缺失型的引物，所述引物為：

16、核苷酸序列如seq?id?no:?1所示的cyp2d6缺失型上游引物；

17、核苷酸序列如seq?id?no:?2所示的cyp2d6缺失型下游引物。

18、在一些具體的實施方案中，所述cyp2d6缺失型引物包含熒光標記，所述熒光標記選自fam、vic、hex、joe、rox、tamra和cy5熒光標記，所述熒光標記位于所述cyp2d6缺失型上游引物的5’端。

19、本發明還提供了一種檢測cyp2d6缺失型別的方法，所述方法包括以下步驟：

20、（1）使用本公開所述的試劑盒中的pcr擴增體系對樣品dna進行pcr反應；

21、（2）對步驟1獲得的pcr產物用本公開所述的試劑盒中的內切酶進行酶切；

22、（3）將步驟2獲得的酶切產物上基因分析儀進行片段分析；

23、（4）結果判讀；

24、所述方法為非診斷目的的。

25、在一些具體的實施方案中，所述方法還包括樣品dna的提取。

26、在一些具體的實施方案中，所述方法的步驟（1）中所述pcr反應的條件為：98℃預變性10min；98℃變性10s，60℃退火20s，72℃延伸1min30s，共?32個循環；72℃延伸10min。

27、在一些具體的實施方案中，所述方法的步驟（2）中所述酶切的反應條件為：37℃酶切30-60min。

28、在一些具體的實施方案中，所述方法的步驟（4）中的結果判讀方法為，在以下情況中，則為cyp2d6缺失型：

29、若用kpni內切酶進行酶切，140bp附近有fam、vic/hex/joe、rox、tamra或cy5熒光標記峰信號；

30、若用pvuii內切酶進行酶切，253bp附近有fam、vic/hex/joe、rox、tamra或cy5熒光標記峰信號；

31、若用avai/bsobi內切酶進行酶切，308bp附近有fam、vic/hex/joe、rox、tamra或cy5熒光標記峰信號；

32、若用ndei內切酶進行酶切，554bp附近有fam、vic/hex/joe、rox、tamra或cy5熒光標記峰信號。

33、本發明還提供了本公開所述的試劑盒或本公開所述的引物和探針在cyp2d6缺失型的檢測中的應用；所述應用為非診斷目的的。

34、在本文中，非診斷目的的應用場景包括例如檢測離體樣本中的cyp2d6基因以供研發使用等。

35、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。

36、本發明所用試劑和原料均市售可得。

37、本發明的積極進步效果在于：

38、與現有技術相比，本發明的方法具有靈敏度較高，操作簡單，檢測時間較短，檢測結果清晰準確便于判讀的優點。