本技術涉及發(fā)酵工程領域，具體涉及一種使用假絲酵母菌制備槐糖脂的方法。

背景技術：

1、槐糖脂是一種由酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的生物表面活性劑，從結構上分為內(nèi)酯型和酸型，不同構型的產(chǎn)品有著不同的性能。內(nèi)酯型槐糖脂有著良好的生物活性及較低的毒性，在醫(yī)藥領域中有廣泛的應用；酸型槐糖脂有良好的表面活性及溶解性，在日化領域有著廣泛的應用。與傳統(tǒng)的化學合成表面活性劑相比，槐糖脂生物表面活性劑不僅具有增溶、乳化、潤濕、降低表面張力等作用，而且具有無毒、可生物降解、對環(huán)境友好等特性，未來在替代傳統(tǒng)化學表面活性劑方面有極大的應用潛力。

2、由于不同構型產(chǎn)物有著不同的應用領域，因此如何靈活制備不同酸型比例構型產(chǎn)品以滿足不同下游需求就成了目前限制槐糖脂應用的主要問題。此外生產(chǎn)成本過高也是限制因素之一，因此篩選高產(chǎn)菌株、降低原料成本，優(yōu)化發(fā)酵條件提升產(chǎn)量，優(yōu)化分離工藝提升產(chǎn)品收率及純度均是目前槐糖脂研究的重點。有通過分離槐糖脂混合物得到單一構型為主的產(chǎn)物，如專利cn201410617794.6?報道了通過結晶、萃取等分離手段從槐糖脂混合物中分離出內(nèi)酯型產(chǎn)物，但未涉及酸型產(chǎn)物的回收，導致整體收率偏低。發(fā)酵生產(chǎn)的生物表活在分離過程中一般會產(chǎn)生大量三廢，如廢水、廢菌體等，如何有效回收利用這些三廢也是降低生產(chǎn)成本的有效方法，但目前尚未有報道可對槐糖脂的三廢進行回收利用。也有采用樹脂吸附分離、有機溶劑萃取以及柱層析的方法分離提純制備槐糖脂和鼠李糖脂的技術。專利申請cn109678914a采用離子交換樹脂和大孔吸附樹脂處理含有油脂組分的槐糖脂溶液，在處理離子交換樹脂和大孔吸附樹脂過程中大量使用乙醇、乙酸乙酯、鹽酸以及氫氧化鈉等試劑，同時由于菌體殘渣及蛋白等污染物的存在，離子交換樹脂和大孔吸附樹脂也存在使用壽命有限、成本高以及過程處理復雜的問題，且有大量三廢的排放。

3、因此，本領域亟需開發(fā)出新型用于制備槐糖脂的方法。

技術實現(xiàn)思路

1、基于此，有必要至少提供一種使用假絲酵母菌制備槐糖脂的方法。

2、在本技術的第一方面，提供一種制備槐糖脂的方法，所述方法包括：

3、將假絲酵母菌的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵：所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含60g/l~100?g/l葡萄糖、60?g/l~100?g/l菜籽油、6?g/l~10?g/l酵母粉和1?g/l~3?g/l磷酸氫二鉀，發(fā)酵ph為3.0~4.0；發(fā)酵溫度為30℃~33℃，維持發(fā)酵液中的溶解氧相對值為28%~32%；

4、補料：在發(fā)酵48?h~52?h后開始添加補料培養(yǎng)基，到發(fā)酵144?h~152?h后停止補料，所述補料培養(yǎng)基包含60?g/l~100?g/l葡萄糖、60?g/l~100?g/l菜籽油和6?g/l~10?g/l酵母粉。

5、在一些實施方式中，所述假絲酵母菌包括工程菌atcc22214。

6、在一些實施方式中，添加補料培養(yǎng)基的方式為連續(xù)添加，補料的速度為20?g/(l·h)~25?g/(l·h)。

7、在一些實施方式中，所述方法還包括種子培養(yǎng)；所述種子培養(yǎng)包括一級種子培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)。

8、在一些實施方式中，用于一級種子培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基各自獨立地包含2?g/l~5?g/l葡萄糖、8?g/l~10?g/l酵母粉和2?g/l~3g/l硫酸銨。在一些實施方式中，用于一級種子培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基的ph各自獨立地為3.0~4.0。

9、在一些實施方式中，一級種子培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)的條件各自獨立地包括：溫度為30℃~33℃；時間為24?h~48?h。在一些實施方式中，溫度為30℃~31℃。在一些實施方式中，時間為30?h~36?h。

10、在一些實施方式中，一級種子培養(yǎng)獲得的一級種子液的od600值大于5。在一些實施方式中，一級種子培養(yǎng)獲得的一級種子液的od600值為5.1~5.5。

11、在一些實施方式中，二級種子培養(yǎng)獲得的二級種子液的od600值大于5。在一些實施方式中，二級種子培養(yǎng)獲得的二級種子液的od600值為5.1~5.5。

12、若無特殊說明，本技術中的術語“od”是optical?density（光密度）的縮寫，光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量存在定量關系。“od600”是將波長設定為600nm時測定的光密度值，是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物密度的標準指標，通常用來指示菌體細胞密度。檢測od值來指示菌體濃度是本領域的常規(guī)使用方法，od值和菌體濃度呈線性關系。

13、在一些實施方式中，所述一級種子液的接種量為2?%（v/v）~8?%（v/v），例如為3?%（v/v）~5?%（v/v）；“%（v/v）”為種子液占待接種至的種子培養(yǎng)基的體積百分比。

14、在一些實施方式中，所述二級種子液的接種量為3?wt%~8?wt%，例如為4?wt%~5wt%；“wt%”為二級種子液占待接種至的發(fā)酵培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比。

15、在一些實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基占發(fā)酵容器體積的30%~50%。在一些實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基占發(fā)酵容器體積的35%~40%。

16、在一些實施方式中，所述方法還包括對發(fā)酵所得發(fā)酵液進行分離純化；

17、所述分離純化包括：

18、a.?向發(fā)酵液加入乙酸乙酯，攪拌、靜置至完全分相，收集、保留上層液體；

19、b.?向所述上層液體中加入烷烴溶劑，攪拌、靜置至完全分相，收集、保留下層液體；以及，

20、c.?對所述下層液體進行溶劑脫除，以制備高純內(nèi)酯型槐糖脂；脫除的方式可選地包括減壓蒸發(fā)。

21、在一些實施方式中，步驟a滿足如下c1）~c4）所示條件中的一項或多項：

22、c1）乙酸乙酯的加入量為發(fā)酵液體積的0.5倍至1.5倍，可選地為1倍；

23、c2）攪拌和靜置各自獨立地在20℃~40℃下進行；

24、c3）攪拌的轉速為150?rpm~250?rpm，時間為10?min~20?min；

25、c4）靜置的時間為2?h~6?h。

26、在一些實施方式中，步驟b滿足如下d1）~d5）所示條件中的一項或多項：

27、d1）烷烴溶劑的加入量為下層液體的0.5倍至1倍；

28、d2）攪拌和靜置各自獨立地在20℃~40℃下進行；

29、d3）烷烴溶劑選自正己烷、正庚烷和正辛烷中的任一種；

30、d4）攪拌的轉速為100?rpm~200?rpm，時間為30?min~60?min；

31、d5）靜置的時間為10?h~20?h。

32、在一些實施方式中，所述分離純化還包括旁處理步驟；

33、所述旁處理步驟包括對步驟a中完全分相后獲得的下層液體進行噴霧干燥得到粉狀固體，制備槐糖脂粗產(chǎn)品；噴霧干燥的溫度可選地為110℃~120℃。

34、在一些實施方式中，所述方法還包括基于高純內(nèi)酯型槐糖脂制備不同酸型比例的產(chǎn)品，包括：

35、將所述高純內(nèi)酯型槐糖脂與堿液和水按比例混合后，攪拌熟化；制備不同酸型比例的產(chǎn)品。

36、在一些實施方式中，攪拌的速度為150?rpm~250?rpm，攪拌的時長為5?h~10?h。

37、在一些實施方式中，所述堿液包括naoh水溶液；所述naoh水溶液的質(zhì)量濃度可選地為5?wt%~20?wt%。

38、含有本技術備槐糖脂的方法工藝簡單，便于操作，大大簡化了生產(chǎn)不同構型槐糖脂產(chǎn)品的工藝難度，使得用相同生產(chǎn)設備生產(chǎn)不同構型產(chǎn)品的可行性大大提升，一定程度上降低了生產(chǎn)成本；最終產(chǎn)品中單一構型產(chǎn)品比例高。