本發明涉及分子檢測，具體涉及一種基于重組酶介導擴增技術的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲多重檢測方法。

背景技術：

1、?凡納濱對蝦原產于太平洋東岸，于20世紀80年代末引入我國，其生長速度快、肉質鮮美、繁殖力強，具有較高的經濟價值，目前成為我國重要的水產養殖品種。聯合國糧食及農業組織（food?and?agriculture?organization，fao）統計數據顯示，2022年我國凡納濱對蝦總產量達到了209.86萬噸。但近年來我國凡納濱對蝦養殖業深受副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原毒害，造成了一定的經濟損失。副溶血弧菌（vibrioparahaemolyticus，vp）是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，2010年，由副溶血性弧菌引起的凡納濱對蝦急性肝胰腺壞死?。╝cute?hepatopancreaticne-crosis?disease，ahpnd）首次被發現，它是凡納濱對蝦養殖中細菌性疾病最主要的致病菌，同時它也是一種人、漁共致病的病原菌，進入人體后會引起食源性中毒和急性腹瀉，嚴重威脅到公共衛生健康安全；白斑綜合癥病毒（white?spot?syndrome?virus，wssv）屬線頭病毒科白斑病毒屬，是一種毒力極強的病原體，遍及亞洲主要養殖地區，被感染動物的死亡率可達100％，已成為全球對蝦養殖危害最大的疫病之一；肝腸胞蟲（enterocytozoon?hepatopenaei，ehp）是專性細胞內寄生的原生生物，是一種專性細胞內寄生的微孢子蟲，2009年于泰國養殖池塘生長遲緩的斑節對蝦中發現，近年來，ehp在我國養殖對蝦中流行率居高不下，已成為危害我國養殖對蝦的重要病原之一。

2、因此，本領域亟需一種快速、準確、敏感的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲檢測方法，避免病原學鏡檢、血清學抗體檢測和聚合酶鏈式反應（polymerase?chainreaction,pcr）的弊端，檢測副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲的靶基因并滿足疾病檢測和篩查的需求。

3、近年來，迅速發展的等溫擴增技術（isothermal?amplification?technology）以其恒溫條件下通過某些酶對核酸的高效率擴增，大大降低了對儀器設備的依賴性，并提高了反應的時效性，擺脫了核酸擴增中對于實驗條件的限制。其中，重組酶介導擴增（recombinase-aided?amplification，raa）技術具有靈敏度高、特異性高的優勢，它不需要昂貴的實驗設備和耗材，應用范圍更廣，操作更簡單。其對dna或rna的快速擴增可在較低溫度下實現，反應速度快，5-30?min內即可獲得擴增產物。基于以上優勢，raa技術在病原體檢測中展現出巨大潛力，然而，針對副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原的多重檢測，仍面臨諸多挑戰。首先，raa技術要求擴增片段較短（90-300?bp），這限制了可選的靶基因范圍。為實現對三種病原的準確檢測，需要對三種病原的基因序列進行了全面分析，篩選出高度保守且具備種屬特異性的目標片段，以實現擴增效率高、特異性強的檢測要求。其次，多重檢測需要在同一反應體系中實現三種病原的同步擴增，這對引物-探針組合的兼容性提出了更高要求。此外，本研究在多重檢測體系中創新性地引入了特異性熒光探針，確保不同病原信號的獨立識別。本發明克服了raa技術在靶標篩選、多重引物探針設計及復雜樣本檢測中的技術瓶頸，建立了一種基于raa的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原檢測方法，為副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲的快速、準確檢測提供了一種創新性解決方案。

技術實現思路

1、為解決上述技術問題，本發明提供一種基于raa技術的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲的多重檢測方法，所述檢測方法分別根據登錄號為jq929914.1的副溶血弧菌基因片段、登錄號為kr057961.1的白斑綜合癥病毒基因片段和登錄號為kx981865.1的蝦肝腸胞蟲基因片段進行設計并針對每個病原都篩選出一對特異性raa引物和一條探針，合成陽性質粒并構建熒光raa反應體系，進行熒光raa檢測。

2、本發明技術方案如下：

3、本發明的第一個目的是提供一種用于重組酶介導擴增檢測副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原的引物探針組合，所述引物探針組合包括：

4、（1）用于檢測副溶血弧菌的特異性重組酶介導擴增引物及探針：

5、正向引物vp-f：

6、5’-cttcatgttgatgacactgccagatgcgacgaa-3’，如seq?id?no.1所示；

7、反向引物vp-r：

8、5’-ttagcgtctcgaacaaggcgtgagtatcaaac-3’，如seq?id?no.2所示；

9、探針vp-p：

10、5’-3’依次連接的seq?id?no.7-iroxdt-t-idsp-g-ibhq2dt-?seq?id?no.8-c3-spacer；

11、5’-agtactcaacacaagaagagatcgacaaaa-iroxdt-t-idsp-g-ibhq2dt-gcgaaagtgcttgag-c3-spacer-3’；

12、其中，“iroxdt”是rox（馬來酰亞胺）熒光標記的dt核苷酸，“idsp”指堿基缺失，“ibhq2dt”是帶有bhq2淬滅基團標記的dt核苷酸，“c3-spacer”指3’羥基封閉。

13、（2）用于檢測白斑綜合癥病毒的特異性重組酶介導擴增引物及探針：

14、正向引物：

15、wssv-f?：5’-catcgaaacccacacaggcaatatcgagaca-3’，如seq?id?no.3所示；

16、反向引物：

17、wssv-r：5’-gatccgcatcttcttccttcatctgtgcatc-3’，如seq?id?no.4所示；

18、探針wssv-p：

19、5’-3’依次連接的seq?id?no.9-ihexdt-g-idsp-a-ibhq1dt-?seq?id?no.10-c3-spacer；

20、5’-aaacctccgcattcctgtgactgctgaggt-ihexdt-g-idsp-a-ibhq1dt-caggctacttcaaga-c3-spacer-3’。

21、其中，“ihexdt”是hex（六氯熒光素）熒光標記的dt核苷酸，“idsp”指堿基缺失，“ibhq1dt”是帶有bhq1淬滅基團標記的dt核苷酸，“c3-spacer”指3’羥基封閉。

22、（3）用于檢測蝦肝腸胞蟲的特異性重組酶介導擴增引物及探針：

23、正向引物：

24、ehp-f：5’-agacaccgctgtagttctagcagtaaactatgcc-3’，如seq?id?no.5所示；

25、反向引物：

26、ehp-r：5’-ccgcgttgagttaaattaagcagcacaatccac-3’，如seq?id?no.6所示；

27、探針ehp-p：

28、5’-3’依次連接的seq?id?no.11-i6famdt-idsp-ibhq1dt-?seq?id?no.12-c3-spacer；

29、5’-acaatgctgggtgttgcgagagcgatgcttgg-i6famdt-idsp-ibhq1dt-gggagaaatcttagt-c3-spacer-3’。

30、其中，“i6famdt”是fam（羧基熒光素）熒光標記的dt核苷酸，“idsp”指堿基缺失，“ibhq1dt”是帶有bhq1淬滅基團標記的dt核苷酸，“c3-spacer”指3’羥基封閉。

31、本發明的第二個目的是提供前述引物探針組合在制備用于重組酶介導擴增檢測副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原的試劑或試劑盒中的應用。

32、本發明的第三個目的是提供一種重組酶介導擴增檢測副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原的試劑盒，所述試劑盒包括前述引物探針組合。

33、進一步的，所述試劑盒還包括重組酶介導擴增試劑、緩沖液、去離子水和激活劑。

34、進一步的，所述重組酶介導擴增試劑包括重組酶、dna聚合酶、單鏈dna結合蛋白、dntp和核酸外切酶；

35、在某個特殊的實施例中，所述重組酶介導擴增試劑購于安普未來（常州）生物科技有限公司（產品型號：wle8202kit）。

36、所述緩沖液為體積百分含量為20%的peg溶液；所述激活劑為摩爾濃度280mm的醋酸鎂。

37、本發明的第四個目的是提供一種基于raa的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲三種病原的多重檢測方法，所述檢測方法分別根據副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲基因片段進行靶序列篩選，分別設計并篩選出一對特異性raa引物和一條探針，構建熒光raa反應體系，進行熒光raa檢測，具體地，所述副溶血弧菌基因片段為副溶血弧菌tlh基因片段，白斑綜合癥病毒基因片段為白斑綜合癥病毒vp28基因片段，蝦肝腸胞蟲基因片段為蝦肝腸胞蟲18s?rrna基因片段。

38、所述方法包括以下步驟：

39、s1、提取待測組織樣本中的總dna，得到dna模板；

40、s2、熒光重組酶介導擴增反應體系的構建：將前述的正向引物、反向引物和探針加至含有重組酶介導擴增試劑的重組酶介導擴增反應單元中，再向重組酶介導擴增反應單元中加入s1得到的dna模板、緩沖液、去離子水和激活劑，構建熒光重組酶介導擴增反應體系；

41、s3、熒光重組酶介導擴增檢測：將構建好的重組酶介導擴增反應體系，放置于熒光定量pcr儀中，進行熒光重組酶介導擴增檢測。

42、進一步的，s3所述熒光重組酶介導擴增檢測的體系為50μl，包含：所述正向引物共2μl、所述反向引物共2μl、緩沖液29.4μl、所述探針共0.6μl、所述dna模板6μl和激活劑2.5μl，以去離子水補充至50μl混勻并轉移至含重組酶介導擴增試劑的重組酶介導擴增反應單元。

43、進一步的，s3所述熒光重組酶介導擴增檢測的體系中，正向引物、反向引物和探針的濃度為10μm。

44、進一步的，s3所述熒光重組酶介導擴增檢測的條件為：反應設置每個循環為30s，溫度恒定為39℃，共設置40個循環，共反應20min。

45、s2所述熒光重組酶介導擴增反應體系構建后，多次顛倒反應單元使溶液充分混勻并離心，離心結束后迅速進行熒光重組酶介導擴增檢測。

46、本發明有益效果在于：

47、本發明建立的副溶血弧菌、白斑綜合癥病毒和蝦肝腸胞蟲檢測技術相比于同為分子檢測的qpcr技術相比具有一定的優勢，本方法能在20min內完成整個檢測過程，大大縮短了檢測時間；最低檢測限可達102copies/μl，保證了較高的敏感性；且與其他常見的對蝦病原沒有交叉反應，特異性優異。該方法基于恒溫擴增技術，克服了傳統核酸檢測的設備限制，簡化了操作流程，有利于在基層、現場或資源有限的環境中對三種病原進行檢測。