本發明涉及生物技術和基因工程領域，尤其涉及了果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用和方法。

背景技術：

1、番茄（ solanum?lycopersicuml.）是一種在全球范圍內被廣泛種植和消費的經濟作物。軟化是番茄果實品質的重要指標，直接影響果實的適口性。番茄果實過度軟化將大大縮短貯藏期，嚴重影響商品價值及消費者的體驗。因此，提高果實硬度，延緩番茄軟化進程以延長果實貯藏期、降低損耗成為育種和栽培的核心目標之一。

2、果實軟化涉及細胞壁的分解，包括果膠解聚和水解、半纖維素的解聚等。其中，果膠在維持細胞壁結構完整性和保持細胞間粘附性上發揮了重要作用。在果實軟化進程中，果膠甲酯酶pme（pectin?methylesterase）參與催化果膠去甲酯化，產生的低甲酯化果膠，一方面可被聚半乳糖醛酸酶pg（polygalacturonase）、果膠裂解酶pl（pectin?lyase）等降解酶降解；另一方面，去甲酯化產生的低甲酯化果膠還可以與ca2+等陽離子交聯，形成“蛋殼”結構，即使果膠排列規則，產生果膠凝膠，從而增強細胞壁剛性。由此可見，pme對細胞壁強度和果實的硬度可能具有雙向調節作用。果膠去甲酯化過程不僅受到pme的催化，還受到果膠甲酯酶抑制蛋白pmei（pectin?methylesterase?inhibitor）的拮抗作用，即pmei通過與pme結合形成復合體的方式阻止底物果膠進入pme活性中心以抑制pme活性來共同調控果膠甲酯化過程，可見pmei在平衡果膠甲酯化水平、維持細胞壁中果膠正常代謝中具有重要作用。迄今，有關pmei參與調控果實軟化的研究未見報道。 slpmei3基因在發育早期表達較高，且在膠質表達明顯高于果皮，關于突變體 slpmei3提高番茄果實硬度的嘗試未見報道。

技術實現思路

1、為了解決背景技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種參與調控番茄果實延緩軟化的果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3。本發明利用crispr/cas9技術將 slpmei3基因敲除獲得定向基因編輯的番茄突變體 slpmei3。即通過構建含靶向 slpmei3基因的sgrna的載體，通過遺傳轉化番茄子葉，篩選獲得敲除突變體 slpmei3。所述sgrna序列1如seq?idno.3、seq?id?no.4所示，所述sgrna序列2如seq?id?no.5、seq?id?no.6所示，sgrnas根據 slpmei3核苷酸序列（seq?id?no.1）設計。

2、為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：

3、一、一種果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用：

4、所述應用為改善番茄果實質地和提高貯運性中的應用。

5、所述應用是通過調控番茄果實延緩軟化進而改善番茄果實質地和提高貯運性。

6、所述改善番茄果實質地為改善番茄的果實從未成熟綠果到紅熟果期間的質地。

7、所述應用是通過延緩番茄果實軟化進而改善番茄果實質地和提高貯運性。

8、所述果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3對應的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

9、具體通過敲除番茄中果膠甲酯酶抑制蛋白編碼基因 slpmei3來實現所述應用。

10、二、一種改善番茄果實質地和提高貯運性方法，方法步驟為：

11、首先構建 slpmei3基因敲除載體，進而將 slpmei3基因敲除載體轉入農桿菌，隨后用轉入 slpmei3基因敲除載體的農桿菌侵染番茄子葉，進行組織培養，篩選獲得番茄突變體；由番茄突變體進行生長繁殖，直到成熟后采摘獲得改善番茄果實質地和提高貯運性后的番茄果實。

12、所述轉入 slpmei3基因敲除載體的農桿菌侵染番茄子葉進行組織培養后，使得番茄突變體成熟后的果實硬度提高從而延緩軟化，進而改善番茄果實質地和提高貯運性。

13、所述果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3對應的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

14、所述方法具體采用crispr/cas9基因編輯方法構建 slpmei3基因敲除載體，轉入 slpmei3基因敲除載體的農桿菌侵染番茄子葉，通過crispr/cas9基因編輯方式將 slpmei3基因敲除，然后將番茄子葉置于培養基上進行組織培養，隨后轉移至土中培養，最終通過基因編輯方法將番茄中的 slpmei3基因敲除。

15、所述 slpmei3基因具體為果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3對應的dna。

16、所述 slpmei3基因敲除載體通過sgrna序列1和sgrna序列2連接至cdc45-1300載體得到，所述sgrna序列1如seq?id?no.3、seq?id?no.4所示，所述sgrna序列2如seq?id?no.5、seq?id?no.6所示。

17、本發明具有的有益效果是：

18、本發明在番茄中敲除果膠甲酯酶抑制蛋白編碼基因 slpmei3（solyc07g042390）獲得了突變體 slpmei3，突變體表型分析顯示未成熟綠果期（immaturegreen，img）、綠熟期（maturegreen，mg）、轉色期（breaker，br）、紅熟期（breaker?+?7，b7）的果實硬度顯著升高，表明 slpmei3基因敲除后可提高番茄果實硬度。本發明有助于提高番茄果實貯運性，減少番茄果實采后損耗，即番茄突變體 slpmei3的果實硬度顯著提高，果實軟化進程延緩，能在改良番茄果實質地和提高貯運性中應用。本發明提供一個提高番茄果實質地及貯運性的候選基因，為番茄品種改良和優質育種提供理論支撐。

技術特征：

1.果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用，其特征在于：所述應用為改善番茄果實質地和提高貯運性中的應用。

2.根據權利要求1所述的果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用，其特征在于：所述應用是通過調控番茄果實軟化進而改善番茄果實質地和提高貯運性。

3.根據權利要求2所述的果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用，其特征在于：所述應用是通過延緩番茄果實軟化進而改善番茄果實質地和提高貯運性。

4.根據權利要求2所述的果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用，其特征在于：所述果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

5.根據權利要求2所述的果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的應用，其特征在于：通過敲除番茄中果膠甲酯酶抑制蛋白編碼基因slpmei3來實現所述應用。

6.一種改善番茄果實質地和提高貯運性方法，其特征在于，方法包括以下步驟：首先構建slpmei3基因敲除載體，進而將slpmei3基因敲除載體轉入農桿菌，隨后用轉入slpmei3基因敲除載體的農桿菌侵染番茄子葉，進行組織培養，篩選獲得番茄突變體；由番茄突變體進行生長繁殖，直到成熟后獲得改善番茄果實質地和提高貯運性后的番茄果實。

7.根據權利要求6所述的一種改善番茄果實質地和提高貯運性方法，其特征在于：所述果膠甲酯酶抑制蛋白slpmei3的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

8.根據權利要求6所述的一種改善番茄果實質地和提高貯運性方法，其特征在于：所述方法具體采用基因編輯方法構建slpmei3基因敲除載體，用轉入slpmei3基因敲除載體的農桿菌侵染番茄子葉，通過基因編輯方式將slpmei3基因敲除，然后將番茄子葉置于培養基上進行組織培養，隨后轉移至土中培養。

9.根據權利要求8所述的一種改善番茄果實質地和提高貯運性方法，其特征在于：所述slpmei3基因敲除載體通過sgrna序列1和sgrna序列2連接至cdc45-1300載體得到，所述sgrna序列1如seq?id?no.3、seq?id?no.4所示，所述sgrna序列2如seq?id?no.5、seq?idno.6所示。

技術總結
本發明公開了果膠甲酯酶抑制蛋白SlPMEI3的應用和方法。所述應用為改善番茄果實質地和提高貯運性中的應用，通過延緩番茄果實軟化進而改善番茄果實質地和提高貯運性，具體是通過敲除番茄中果膠甲酯酶抑制蛋白編碼基因SlPMEI3來實現所述應用。本發明敲除果膠甲酯酶抑制蛋白編碼基因SlPMEI3可顯著提高果實硬度，進而延緩軟化進程。本發明有助于提高番茄果實貯運性，減少番茄果實采后損耗。

技術研發人員：陳昆松,譚浩瀚,石艷娜,趙穎婕,林夏慧
受保護的技術使用者：浙江大學
技術研發日：
技術公布日：2025/4/24