本發(fā)明涉及分子檢測(cè)，特別是涉及一種多肽探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體是細(xì)胞分泌的一種納米級(jí)囊泡，直徑大約為30-150納米，具有典型的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)，能夠保護(hù)內(nèi)含的蛋白質(zhì)、rna、dna等多種生物分子，并在細(xì)胞間傳遞信息，參與細(xì)胞通信、免疫應(yīng)答、細(xì)胞代謝等多種生理過(guò)程。外泌體的研究對(duì)于揭示疾病機(jī)制、發(fā)展新的診斷標(biāo)志物和治療策略具有重要意義。

2、對(duì)于外泌體功能研究，一般先要觀察到外泌體被受體細(xì)胞攝取或到達(dá)目的組織和器官后，再檢測(cè)受體細(xì)胞、組織或器官中相應(yīng)表型指標(biāo)是否發(fā)生變化。因此，外泌體標(biāo)記和示蹤是外泌體功能研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵步驟。

3、目前已發(fā)表的文獻(xiàn)中，外泌體大多使用親脂性染料進(jìn)行標(biāo)記，其原理是親脂性熒光膜染料將脂肪族的長(zhǎng)尾巴插入外泌體的脂質(zhì)雙層中后發(fā)出穩(wěn)定且持久的強(qiáng)熒光信號(hào)（以非共價(jià)方式嵌入），有助于觀察外泌體與受體細(xì)胞/組織/器官之間的相互作用，在體內(nèi)和體外都有較多應(yīng)用。

4、而目前較常用的小分子熒光探針pkh存在熒光染料自身團(tuán)聚發(fā)出熒光，造成假陽(yáng)性的問題；且用pkh染色后的外泌體也存在團(tuán)聚的問題，外泌體的粒徑大小和分布會(huì)發(fā)生改變。親脂性羰花青染料對(duì)脂質(zhì)的無(wú)條件親和力，缺乏選擇性，可能會(huì)標(biāo)記到非外泌體的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過(guò)轉(zhuǎn)染熒光蛋白的方式不僅需要大量的前期基因工程準(zhǔn)備工作，并且每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)率也不相同，造成分泌的外泌體熒光強(qiáng)度不均勻，且融合蛋白與原始蛋白運(yùn)動(dòng)軌跡不同，影響細(xì)胞功能分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種對(duì)外泌體影響較小，不會(huì)改變其粒徑大小和分布的，同時(shí)自身不會(huì)聚集，假陽(yáng)性低的外泌體富集多肽探針。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一方面，本發(fā)明提供一種多肽探針，所述多肽探針的結(jié)構(gòu)如下：

4、肽鏈1—l—肽鏈2；

5、其中，l為，其中，m為1~15的整數(shù)；

6、所述肽鏈1和所述肽鏈2的氨基酸序列選自以下任一組：

7、（1）seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的氨基酸序列；

8、（2）與seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少80%、82%、85%、87%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，并且其保留如seq?id?no:1或seq?idno:2所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能；

9、（3）在seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，并且其保留如seq?id?no:1或seq?id?no:2所示的氨基酸序列的生物學(xué)功能。

10、優(yōu)選地，所述m為2~10的整數(shù)。

11、優(yōu)選地，所述多肽探針的結(jié)構(gòu)如下：

12、肽鏈肽鏈2；

13、其中，所述肽鏈1的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，所述肽鏈2的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

14、優(yōu)選地，所述肽鏈1的n端連接有熒光素。

15、優(yōu)選地，所述熒光素選自異硫氰酸熒光素、硝基苯并噁二唑、7-氨基-4-甲基香豆素、5-羧基熒光素、丹磺酰氯、cy3和cy5中的一種或多種。

16、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述熒光素選自異硫氰酸熒光素、硝基苯并噁二唑、5-羧基熒光素、cy3和cy5中的一種或多種。

17、優(yōu)選地，所述熒光素通過(guò)6-氨基己酸與肽鏈1的n端相連接。

18、一方面，本發(fā)明提供上述任一項(xiàng)所述的多肽探針在制備檢測(cè)和/或富集外泌體試劑中的應(yīng)用。

19、一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)外泌體的方法，所述方法包括上述任一項(xiàng)所述多肽探針與待測(cè)樣本共孵育，檢測(cè)熒光信號(hào)。

20、優(yōu)選地，所述多肽探針的濃度為400~600nm。

21、發(fā)明的效果：

22、本發(fā)明提供的外泌體檢測(cè)多肽探針能夠直接對(duì)外泌體膜進(jìn)行染色，無(wú)需復(fù)雜的基因工程設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)便，短時(shí)間即可完成標(biāo)記，具備高特異性。本發(fā)明提供的多肽片段中富含賴氨酸（k）和精氨酸（r），因此，能夠與外泌體膜上負(fù)電荷分子如ps、pi產(chǎn)生強(qiáng)靜電作用，進(jìn)而與外泌體膜進(jìn)行結(jié)合。同時(shí)，外泌體膜上的磷脂酰絲氨酸（ps）通常暴露在外側(cè)（與正常細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的ps分布不同），因此本發(fā)明提供的多肽探針能更容易結(jié)合到外泌體膜，而不會(huì)對(duì)普通細(xì)胞膜產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性結(jié)合。同時(shí)，多肽中的疏水性氨基酸（如苯丙氨酸（f）、亮氨酸（l））能夠插入到磷脂雙分子層的疏水核心區(qū)域，進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)合的穩(wěn)定性。因此本申請(qǐng)通過(guò)靜電作用和疏水插入的作用使外泌體多肽探針能夠更加穩(wěn)定的結(jié)合外泌體膜。

技術(shù)特征：

1.一種多肽探針，其特征在于，所述多肽探針的結(jié)構(gòu)如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽探針，其特征在于，所述m為2~10的整數(shù)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽探針，其特征在于，所述多肽探針的結(jié)構(gòu)如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽探針，其特征在于，所述肽鏈1的n端連接有熒光素。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽探針，其特征在于，所述熒光素選自異硫氰酸熒光素、硝基苯并噁二唑、7-氨基-4-甲基香豆素、5-羧基熒光素、丹磺酰氯、cy3和cy5中的一種或多種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽探針，其特征在于，所述熒光素選自異硫氰酸熒光素、硝基苯并噁二唑、5-羧基熒光素、cy3和cy5中的一種或多種。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多肽探針，其特征在于，所述熒光素通過(guò)6-氨基己酸與肽鏈1的n端相連接。

8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的多肽探針在制備檢測(cè)和/或富集外泌體試劑中的應(yīng)用。

9.一種檢測(cè)外泌體的方法，其特征在于，所述方法包括權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述多肽探針與待測(cè)樣本共孵育，檢測(cè)熒光信號(hào)。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述多肽探針的濃度為400~600nm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種多肽探針及其應(yīng)用，所述多肽探針的結(jié)構(gòu)如下：肽鏈1—L—肽鏈2；其中，L為其中，m為1~15的整數(shù)。本發(fā)明提供的多肽探針能夠特異性的結(jié)合外泌體，操作簡(jiǎn)單，省事省力。

技術(shù)研發(fā)人員：尹航,李振韜,于海倫,吳天來(lái),馬金娜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：億航（蘇州）生物醫(yī)藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24