本發(fā)明屬于基因工程，尤其涉及 alkbh9b基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、森林是陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分，是集水庫(kù)、糧庫(kù)、錢庫(kù)、碳庫(kù)于一身的重要自然資源，而木材作為林業(yè)資源的一部分，在建筑業(yè)、造紙業(yè)和紡織業(yè)等領(lǐng)域中扮演著重要的角色，成為人們?cè)谏a(chǎn)生活中不可或缺的一部分。近年來(lái)人均木材資源較為匱乏，因此，開(kāi)發(fā)與保護(hù)林業(yè)資源，推動(dòng)生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展，已成為當(dāng)務(wù)之急。

2、愈傷組織的形成是植物響應(yīng)環(huán)境傷害和機(jī)械損傷時(shí)的重要自我修復(fù)機(jī)制，它由不定形細(xì)胞簇組成，并為后續(xù)的再生和繁殖提供了細(xì)胞源。其不僅是植物傷口愈合的關(guān)鍵，也是基因轉(zhuǎn)化、組織培養(yǎng)和植株再生的基礎(chǔ)。隨著植物育種技術(shù)的發(fā)展，愈傷組織的形成已經(jīng)成為研究和應(yīng)用的重要環(huán)節(jié)，且會(huì)影響基因工程技術(shù)的應(yīng)用，尤其在林木遺傳改良中，能有效促進(jìn)外源基因的轉(zhuǎn)化，從而快速培育出優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)基因速生林木，這對(duì)于滿足市場(chǎng)需求、緩解木材供需矛盾具有重要意義，并能在一定程度上保障的木材安全，也對(duì)于改善林木的生物量、木材品質(zhì)以及抗逆性等特性具有重要的應(yīng)用前景。

3、n6-甲基腺苷（n6-methyladenosine，m6a）是一種廣泛存在于真核生物mrna中的轉(zhuǎn)錄后修飾，指的是在腺嘌呤的第6位碳原子上添加一個(gè)甲基基團(tuán)。m6a修飾是最為常見(jiàn)且動(dòng)態(tài)可逆的一種rna修飾，由m6a甲基轉(zhuǎn)移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）和m6a結(jié)合蛋白（reader）協(xié)同在植物生長(zhǎng)發(fā)育的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮作用。植物中的去甲基化酶alkbh通過(guò)去除mrna中的甲基化修飾，調(diào)控與植物開(kāi)花時(shí)間、果實(shí)成熟、信號(hào)傳導(dǎo)以及生物和非生物脅迫相關(guān)的基因表達(dá)。因此，alkbh在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，如果mrna中的甲基化修飾無(wú)法被去除，可能會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了 alkbh9b基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用，通過(guò)敲低和/或敲除 alkbh9b基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了 alkbh9b基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用，所述 alkbh9b基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3、優(yōu)選的，通過(guò)敲低和/或敲除 alkbh9b基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

4、優(yōu)選的，所述植物為楊樹。

5、進(jìn)一步優(yōu)選的，促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織的形成。

6、本發(fā)明還提供了含有所述 alkbh9b基因的表達(dá)盒、載體或重組菌在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明還提供了一種利用所述 alkbh9b基因促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成的方法，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，敲低和/或敲除楊樹 alkbh9b基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成。

8、優(yōu)選的，還包括敲低和/或敲除楊樹 alkbh9a基因的步驟，所述 alkbh9a基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9、本發(fā)明還提供了所述 alkbh9a基因在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用。

10、優(yōu)選的，通過(guò)敲低和/或敲除 alkbh9a基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

11、本發(fā)明還提供了所述 alkbh9b基因和所述 alkbh9a基因共同在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用，通過(guò)敲低和/或敲除 alkbh9b基因和 alkbh9a基因，降低 alkbh9b基因和alkbh9a基因的表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：

13、本發(fā)明通過(guò)敲除 alkbh9b基因和/或 alkbh9a基因，降低 alkbh9b基因和/或 alkbh9a基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn) alkbh9b基因單基因敲除的基因編輯株系與 alkbh9b基因和 alkbh9a基因雙基因敲除的基因編輯株系均在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第5d時(shí)，已經(jīng)開(kāi)始形成愈傷組織，而野生株系此時(shí)未見(jiàn)愈傷組織形成，野生株系在第8d時(shí)才開(kāi)始誘導(dǎo)出愈傷。

14、且后續(xù)對(duì)第11、14、20d的愈傷組織進(jìn)行觀察，野生株系的愈傷組織形成速度緩慢，而 alkbh9b基因單基因敲除的基因編輯株系與 alkbh9b基因和 alkbh9a基因雙基因敲除的基因編輯株系的愈傷形成速度較快。

15、 alkbh9b基因單基因敲除的基因編輯株系與 alkbh9b基因和 alkbh9a基因雙基因敲除的基因編輯株系的愈傷凈重量和愈傷產(chǎn)生率均顯著高于野生型株系。這些結(jié)果表明， alkbh9b在葉片誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中起到抑制作用，而其缺失可促進(jìn)愈傷組織的形成。同時(shí)， alkbh9a作為旁系同源基因，在該過(guò)程中也發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。

技術(shù)特征：

1.alkbh9b基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用，其特征在于，所述alkbh9b基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)敲低和/或敲除alkbh9b基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述植物為楊樹。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述應(yīng)用，其特征在于，促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織的形成。

5.含有如權(quán)利要求1中所述alkbh9b基因的表達(dá)盒、載體或重組菌在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用。

6.一種利用alkbh9b基因促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成的方法，其特征在于，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，敲低和/或敲除楊樹alkbh9b基因，降低其表達(dá)量，促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成的方法，其特征在于，還包括敲低和/或敲除楊樹alkbh9a基因的步驟，所述alkbh9a基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

8.alkbh9b基因和alkbh9a基因共同在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用，其特征在于，所述alkbh9b基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述alkbh9a基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于，通過(guò)敲低和/或敲除alkbh9b基因和alkbh9a基因，降低alkbh9b基因和alkbh9a基因的表達(dá)量，促進(jìn)植物愈傷組織快速形成。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了ALKBH9B基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了ALKBH9B基因在促進(jìn)植物愈傷組織形成中的應(yīng)用。還提供了含有ALKBH9B基因的表達(dá)盒、載體或重組菌在促進(jìn)楊樹葉片愈傷組織形成中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)敲除ALKBH9B基因，降低ALKBH9B基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)基因敲除的基因編輯株系在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)第5d時(shí)，已經(jīng)開(kāi)始形成愈傷組織，且愈傷形成速度較快，愈傷凈重量和愈傷產(chǎn)生率均顯著高于野生型株系。表明ALKBH9B在葉片誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中起到抑制作用，而其缺失可促進(jìn)愈傷組織的形成。

技術(shù)研發(fā)人員：張進(jìn),姚鳳鴿,盧孟柱
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/4/24